王加黨，李艷玲，賀永梅，孫曉梅，楊永壽

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

影響美洲大蠊藥材中游離氨基酸測(cè)定的因素研究

王加黨，李艷玲，賀永梅，孫曉梅，楊永壽*

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：研究影響美洲大蠊藥材中游離氨基酸含量測(cè)定的各因素，確定最佳檢測(cè)條件。方法：采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)溶劑濃度、物料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)、活性炭用量、脫色時(shí)間、緩沖溶液的pH值、顯色時(shí)間進(jìn)行考察。結(jié)果：美洲大蠊藥材中游離氨基酸的最佳提取條件為：8倍量65%乙醇，回流提取3次，每次60 min；最佳測(cè)定條件為：脫色時(shí)活性炭和樣品的比例為4∶100，脫色時(shí)間10 min，顯色時(shí)緩沖溶液的pH=6.0，水浴加熱顯色30 min。結(jié)論：該提取條件和測(cè)量方法適用于美洲大蠊中游離氨基酸的含量測(cè)定。

美洲大蠊；游離氨基酸；含量測(cè)定；影響因素

美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus）為昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)〔1〕，俗稱“蟑螂”、“偷油郎”，是世界上最古老、生命力最強(qiáng)的昆蟲(chóng)之一。主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，喜歡陰暗潮濕、溫暖的環(huán)境。因其對(duì)病菌的傳播，故被列為世界性衛(wèi)生害蟲(chóng)〔2〕。但近年來(lái)的研究表明，美洲大蠊具有較高的藥用價(jià)值〔3-7〕。在我國(guó)，美洲大蠊作為藥用昆蟲(chóng)最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，美洲大蠊性寒，味咸，治血瘀癥堅(jiān)寒熱、破積聚、喉咽閉、內(nèi)寒無(wú)子等癥〔8〕，具有破瘀化積、消腫、解毒、通利血脈之功效，常用于治療小兒瘡積、疔瘡、喉蛾、無(wú)名腫毒等。我國(guó)科學(xué)工作者經(jīng)過(guò)多年的研究，發(fā)現(xiàn)美洲大蠊體內(nèi)含有活性很強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，并研發(fā)出“康復(fù)新液”、“肝龍膠囊”、“新脈隆注射液”等藥物。美洲大蠊藥材現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為云南省地方標(biāo)準(zhǔn)，其含量測(cè)定指標(biāo)為游離氨基酸，但在長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊中游離氨基酸測(cè)定方法中每一個(gè)影響因素的改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響都非常大，為了保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們采用單因素試驗(yàn)對(duì)乙醇濃度、脫色時(shí)活性炭的用量、脫色時(shí)間、緩沖溶液的pH值、加熱顯色時(shí)間進(jìn)行考察，采用正交試驗(yàn)對(duì)藥材中游離氨基酸的提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比進(jìn)行考察，以便進(jìn)一步完善美洲大蠊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與儀器

1.1材料美洲大蠊藥材購(gòu)于大理州彌渡縣養(yǎng)殖場(chǎng)，酪氨酸對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所（批號(hào)：110821-200609），水為超純水，其它試劑均為分析純。

1.2儀器TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、梅特勒電子天平AE240（梅特勒儀器有限公司）、DZKW-4電子恒溫水浴鍋（上?？莆鰧?shí)驗(yàn)儀器廠）、超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器公司）、RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、FYB5型萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限責(zé)任公司）、LD4-2型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）、pHS-25C型數(shù)字酸度計(jì)（梅特勒儀器有限公司）。

2 方法

2.1樣品提取取粉碎后過(guò)50目篩的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，加一定濃度的乙醇按實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行回流提取，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮得浸膏，浸膏加約40 mL沸水加熱溶解，靜置放冷、過(guò)濾，除去脂肪層，濾液于50 mL比色管中加蒸餾水定容，加活性炭0.4 g，振搖、靜置、過(guò)濾，濾液即為供試品溶液。

2.2對(duì)照品溶液的配制（50.00μg/mL）精密稱取80℃干燥至恒重的酪氨酸對(duì)照品5.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加0.02 mol/L的NaOH溶液10 mL于沸水浴中加熱至完全溶解，冷卻至室溫，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得。

2.3檸檬酸鹽緩沖溶液的配置精密稱取21.0 g檸檬酸于燒杯中，加200 mL蒸餾水使其充分溶解，滴加1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至試驗(yàn)所需pH值，轉(zhuǎn)移至500 mL量瓶中用蒸餾水定容，搖勻，即得。分別配置pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的檸檬酸鹽緩沖液，備用。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取“2.2”項(xiàng)中制備好的酪氨酸溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，分別加入1 mL檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）和1 mL 1.0%的茚三酮乙醇溶液，搖勻，水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，分別加入60%乙醇3 mL，蒸餾水定容，搖勻，照中國(guó)藥典附錄中分光光度法于570 nm〔9〕處測(cè)定吸光度A。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.004 9C-0.241 2，r=0.999 9，結(jié)果表明酪氨酸含量在50~250μg范圍之間呈良好的線性關(guān)系。

2.5供試品中總氨基酸的含量測(cè)定精密吸取供試品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，照“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”項(xiàng)下的方法自“分別加入1 mL檸檬酸緩沖液”起，依法測(cè)定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出供試品溶液中總氨基酸的含量（μg），并照下列公式換算為美洲大蠊中總氨基酸的含量：

總氨基酸（mg/g）=（C×2.5×0.662）÷W

W為供試品重量（g）；C為氨基酸含量（μg）；2.5為溶液的稀釋倍數(shù)；轉(zhuǎn)換系數(shù)0.662是氨基酸的平均分子量120除以酪氨酸的分子量181.2所得。

3 單因素試驗(yàn)

3.1乙醇濃度的考察〔10〕取粉碎后過(guò)50目篩的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，按“表1”分別加入95%、85%、75%、65%、55%、45%的乙醇溶液回流提取1.5 h，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行提取，按“2.5”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 提取溶劑濃度考察結(jié)果

從表1結(jié)果可知，用65%的乙醇作提取溶劑效果最好，故實(shí)驗(yàn)中采用65%的乙醇作提取溶劑。

3.2脫色時(shí)活性炭用量選擇〔11〕取粉碎后過(guò)50目篩的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，用65%的乙醇回流提取1.5 h后，除加入活性炭的量按“表2”要求外，其它操作按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行提取，按“2.5”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 活性炭比例考察

從表2結(jié)果可知，藥材與活性炭的比例為100∶4或100∶5實(shí)驗(yàn)結(jié)果都較好，故本實(shí)驗(yàn)采用100∶4的活性炭進(jìn)行脫色。

3.3脫色時(shí)間的選擇〔11〕取粉碎后過(guò)50目篩的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，用65%的乙醇回流提取1.5 h后，除脫色時(shí)間按“表3”要求進(jìn)行外，其它操作按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行提取，按“2.5”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 脫色時(shí)間的考察

從表3結(jié)果可知，加活性炭脫色，脫色時(shí)間大于10 min對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響，為了使試驗(yàn)更方便，故本實(shí)驗(yàn)脫色時(shí)間選用10 min。

3.4緩沖溶液pH值的選擇精密吸取“2.1”項(xiàng)中制備好的樣品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按“2.5”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算，顯色時(shí)緩沖溶液的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 緩沖溶液pH值的考察

由表4結(jié)果可知，顯色時(shí)溶液的pH值為6.0時(shí)測(cè)量結(jié)果最高，故確定緩沖溶液pH值為6.0。

3.5顯色時(shí)間的選擇〔12〕精密吸取“2.2”項(xiàng)中制備好的酪氨酸對(duì)照品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按“2.5”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算，顯色時(shí)間和測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 顯色時(shí)間的考察

由表5結(jié)果可知，顯色時(shí)間為30、40、50 min時(shí)測(cè)量結(jié)果都高，但30 min時(shí)測(cè)量結(jié)果較高一些，故確定顯色時(shí)間為30 min。

4 正交試驗(yàn)

4.1提取條件的選擇〔13-15〕為了優(yōu)化提取工藝，根據(jù)美洲大蠊藥材在提取過(guò)程中的影響因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上考慮提取時(shí)間、提取次數(shù)、物料比三個(gè)因素進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。取粉碎后過(guò)50目篩的美洲大蠊干燥粉末10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，用65%的乙醇按照“表6”和“表7”正交試驗(yàn)方案進(jìn)行回流提取，之后，按“2.5”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算。以總氨基酸含量為考察指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 因素水平

表7 L9（33）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析和方差分析表明：這三個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響次序?yàn)锽>A>C，且三個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)都有顯著影響。從而可確定最優(yōu)工藝為A3B3C1，即溶劑用量8倍，提取3次，每次3 h。但因考慮工廠實(shí)際生產(chǎn)以及該實(shí)驗(yàn)條件對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響大小，故可確定最佳組合為A1B3C1，即最優(yōu)工藝為：8倍量溶劑提取3次，每次1 h。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 方差分析表

4.2正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證為驗(yàn)證由正交試驗(yàn)優(yōu)選而得的最佳條件A1B3C1（即8倍量溶劑提取3次，每次1 h）組合的正確性，按此組合做3次平行實(shí)驗(yàn)，得該批美洲大蠊藥材中游離氨基酸的含量為28.84 mg/g（RSD=1.03%），比任何一次試驗(yàn)的含量都高。這就進(jìn)一步證明A1B3C1提取效果最好，為最佳組合。即最優(yōu)提取工藝為：8倍量溶劑提取3次，每次1 h。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)影響美洲大蠊中游離氨基酸測(cè)定的各種因素進(jìn)行研究，結(jié)果表明最佳提取條件為：8倍量65%乙醇，回流提取3次，每次60 min；最佳測(cè)定條件為：脫色時(shí)活性炭和樣品的比例為4∶100，脫色時(shí)間為10 min；顯色時(shí)緩沖溶液的pH為6.0，水浴加熱顯色30 min。

本試驗(yàn)正交結(jié)果顯著性良好，該測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，考察全面，為美洲大蠊中游離氨基酸的準(zhǔn)確測(cè)定提供理論依據(jù)，另外還可為美洲大蠊藥材的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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*通信作者：楊永壽，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師.

（責(zé)任編輯 毛本勇）

Influence Factor Study of the Determination of Free Amino Acids in Periplaneta Americana Medicine

WANG Jiadang,LI Yanling,HE Yongmei,SUN Xiaomei,YANG Yongshou*
（School of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the influence factors of the determination of free amino acids in Periplaneta americana medicine and find out the best testing condition.Methods:Single factor experiment and orthogonal test design were applied to determine the solvent concentration,material ratio,extraction time,extraction times,active carbon dosage,decoloring time,pH value of the buffer solvent and coloring time.Results:The optimum extraction condition for free amino acids from the Periplaneta americana is that reflux extraction is applied to the 8 times of 65%ethanol for 3 times with each time lasting 60 minutes;the optimum testing condition lies when the ratio between active carbon and the sample is 4:100 in the 10 minutes'decolorization,and the pH value of the butter solvent is 6.0 in coloring and then water bath heating is applied for 30 minutes.Conclusion:The extraction and testing conditions are suitable for testing the amount of free amino acids in Periplaneta americana.

Periplaneta americana;free amino acids;content determination;influence factor

R284.2

A

1672-2345（2011）12-0012-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81060329）

2011-04-28

2011-08-30

王加黨，藥學(xué)專業(yè)本科生.