李平平，柳生奎，邱志奇，安志剛*

(1.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，哈爾濱150040;2.廣州中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510275)

重金屬是一類主要的環(huán)境污染物，對(duì)生物的生存構(gòu)成嚴(yán)重威脅。有些重金屬如 Co，Cu，F(xiàn)e，Mn，Ni，Zn是生物體所必需的微量元素，通過形成穩(wěn)定的復(fù)合物在生化反應(yīng)中起著重要的作用。如催化代謝反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)［1-3］。生物體所需這些重金屬含量是極低的。而其他非必需重金屬如Ag，Al，Cd，Au，Pb和Hg則沒有任何生理生化作用，非必需重金屬元素和過量的必需重金屬元素對(duì)生物都是有害的。重金屬對(duì)生物體的毒害作用主要有三種:軟性金屬，如Cd，Hg，Ag能夠與巰基發(fā)生化學(xué)作用［4］，使得活性位點(diǎn)含有巰基的酶失去活性，或者與細(xì)胞內(nèi)重要的微量元素相互作用，抑制其生理功能［3］。有氧化還原活性的重金屬，如Cu，F(xiàn)e，Mn直接參與氧化反應(yīng)。其他重金屬，如 Ni，Co，Zn能夠通過呼吸作用、光合作用氧化傳遞鏈的解耦聯(lián)，或降低谷胱甘肽 (GSH)含量間接造成氧化逆境，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基積累。

真核生物體內(nèi)存在一些蛋白或多肽類，如金屬硫蛋白 (MTs)、谷胱甘肽 (GSH)和植物絡(luò)合素(phytochelatins，PCs)等所具有的-SH具有與金屬離子結(jié)合形成硫肽復(fù)合物的功能，這些復(fù)合物通過一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用能夠運(yùn)輸?shù)桨?，或者將其?chǔ)存在液泡等細(xì)胞器內(nèi)，降低重金屬的毒性。金屬硫蛋白主要參與銅離子平衡，而植物絡(luò)合素(PCs)和谷胱甘肽 (GSH)則主要對(duì)Cd離子的有效解毒起主要作用。

谷胱甘肽 (GSH)是由谷氨酸和半胱氨酸、甘氨酸三個(gè)氨基酸組成的三肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，主要由谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶 (GS)催化的兩個(gè)連續(xù)反應(yīng)合成，其中γ-GCS受產(chǎn)物GSH的反饋抑制。編碼γ-GCS和GS的基因gshA及gshB已被測(cè)序并克隆出來，早期研究表明γ-GCS催化活性受GSH的反饋抑制［5］。GSH有多種生物功能，與其分子結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系。分子結(jié)構(gòu)中的活性巰基重要的生化作用，使其能絡(luò)合金屬離子，降低重金屬對(duì)細(xì)胞的毒害。且其作為一種抗氧化劑，能夠清除重金屬毒性產(chǎn)生的活性氧自由基。所以，提高GSH的含量可能提高生物體對(duì)重金屬的耐性。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物、微生物體內(nèi)過量表達(dá)大腸桿菌γ-GCS或GS，可以將GSH含量提高2～6倍［6］。在印度芥菜中分別過量表達(dá)了γ-GCS、GS這兩種酶，均增加了植物對(duì)Cd的耐性和積累［7-8］。但在擬南芥中過量表達(dá)γ-GCS卻未增加Cd的耐性［9］。在煙草中過量表達(dá)大腸桿菌的γ-GCS反而引發(fā)了嚴(yán)重的氧化脅迫［10］。這種表型可以通過轉(zhuǎn)入GS部分恢復(fù)過來。在以后的研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)钠胶猞?GCS和GS這兩種酶的活性、并且定位在相同的部位 (細(xì)胞質(zhì)或質(zhì)體)是提高GSH含量的關(guān)鍵［6］。

在植物、微生物體內(nèi)表達(dá)革蘭氏陽性菌無乳鏈球菌的谷胱甘肽合成酶基因StGCS-GS可以解決這一問題。該功能基因是編碼具有γ-GCS和GS兩種活性的雙功能融合蛋白γ-GCS-GS，且γ-GCS的催化活性對(duì)GSH的反饋抑制不敏感。Bjorn等研究也表明GSH對(duì)S.agalactiae的γ-GCS-GS的的γ-GCS催化活性影響較小，且在應(yīng)用試驗(yàn)的條件下，S.agalactiae的細(xì)胞中確實(shí)積累了大量的GSH(304 ± 11nmol/mg protein)［11］。Verena 等在煙草中表達(dá)這種酶，葉片中積累了大量的GSH，是野生型的20～30倍，且未對(duì)植株生長(zhǎng)產(chǎn)生有害影響，并表現(xiàn)出對(duì)Cd較強(qiáng)的耐性［6］。目前未見在原核生物中過量表達(dá)該酶的報(bào)道。

本文將無乳鏈球菌的同屬菌嗜熱鏈球菌 (S.thermophilus)的功能基因StGCS-GS轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到了轉(zhuǎn)化菌株，并對(duì)其在重金屬Cd、Ni、Cu脅迫條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

所用大腸桿菌 (Eshenchia coli)菌株為Rosetta-gamiTM(含有質(zhì)粒pETG-10A+GCSGS)。起始質(zhì)粒為pETG-10A，質(zhì)粒圖如圖1所示。采用Gateway技術(shù)將StGCS-GS基因克隆到原核表達(dá)載體pETG-10A上 (與中山大學(xué)合作)。

1.1.2 試劑

生物素標(biāo)記的羊抗兔Ig G抗體 (與中山大學(xué)合作開發(fā))。

圖1 質(zhì)粒圖Fig.1 Plasmid map

1.2 方法

1.2.1 His-GCS-GS融合蛋白的表達(dá)與純化

取含有質(zhì)粒pETG-10A+GCS-GS的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物各2 ml，加入到含有50 μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并在37℃的溫度下振蕩培養(yǎng)，待菌液濃度為OD600=0.5時(shí)，加入0.1 mM IPTG，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。收集菌液。6 000 g/4℃/10 min離心，棄上清，沉淀至于冰上。加入5ml冰冷的裂解緩沖液 (50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10mM imidazole，PH 8.0)，懸浮細(xì)胞沉淀;再向懸浮液中加入含1 ml 10 g/L溶菌酶、6 μl 1M PMSF，冰浴30 min，進(jìn)行細(xì)胞裂解;13 000 g/30 min/4℃ 離心，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。與此同時(shí)加入1 ml Ni-agarose于蛋白純化柱中，靜止30min。然后加蛋白液于柱中，進(jìn)行目的蛋白的純化;待總蛋白溶液被充分吸附后，用5倍體積的漂洗緩沖液 (50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20mM imidazole，PH 8.0)漂洗雜蛋白;清洗完畢后，加入300 μl洗脫緩沖液 (50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250mM imidazole，PH 8.0)，靜止30min，收集洗脫液，重復(fù)3次。取15 μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行膠染色;純化后的目的蛋白置PB(pH 7.0)緩沖液中，過夜透析。取適量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并進(jìn)一步Western blot檢測(cè)。

1.2.2 Western blot

SDS-PAGE結(jié)束后，取出膠，置轉(zhuǎn)移緩沖液(20 ml Tris-base，11.26 g甘氨酸，200 ml甲醇，dH2O容至1L)浸泡20min。將表達(dá)產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，加入新鮮配制的封閉液 (含5%的脫脂奶粉的的TBS)4℃封閉過夜。棄去封閉液，加入一抗 (1:5000)室溫振蕩孵育1h。將結(jié)合了一抗的硝酸纖維膜置于洗膜緩沖液 (加200μl Tween 20于200mldH2O中)中洗3次，每次10min。用生物素標(biāo)記的羊抗兔Ig G為二抗 (1;2000)室溫振蕩孵育1h。洗去二抗，用100ml檢測(cè)平衡液 (100mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 9.5)平衡，1～5min。NBT/BCIP室溫避光顯色至出現(xiàn)理想條帶，照相。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因大腸桿菌在重金屬脅迫條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)的比較

將含有pETG-10A+GCS-GS和野生型的大腸桿菌 (Rosetta-gamiTM)單克隆接種于2mlLB液體培養(yǎng)基中37℃/200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取5ul菌液加入200mlLB中擴(kuò)大培養(yǎng)10h。測(cè)定OD600，計(jì)算使50ml菌液濃度OD值達(dá)到0.5所需菌液的量，3000rpm/10min集菌，將收集的菌體加入50ml對(duì)照培養(yǎng)基以及分別含有0.5mM CdCl2、0.75mM CdCl2、1mM CdCl2、1Mm NiSO4、2mM NiSO4、3mM NiSO4、0.5 mM、1.5 mM、3 mM 和 5mM CuCl2的LB培養(yǎng)基中，37℃/200rpm振蕩培養(yǎng)。每2h測(cè)一次OD600值，共測(cè)定20h，并用Excel表格對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖2 純化融合蛋白His-GCS-GS在濃度10%上的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.2 10%SDS-PAGE of His-GCS-GS proteins isolated by affinity chromatography from culture supernatant

2 結(jié)果與分析

2.1 His-GCS-GS融合蛋白的純化與鑒定

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析和透析脫鹽后，取適量進(jìn)行SDS-PAGE并進(jìn)一步Western Blot鑒定。SDSPAGE結(jié)果顯示純化后融合蛋白純度較高如圖2所示，Western blot結(jié)果證實(shí)成功獲得His-GCS-GS融合蛋白如圖3所示。

圖3 利用抗體對(duì)His-GCS-GS融合蛋白進(jìn)行Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of His-GCS-GS fusion protein

2.2 轉(zhuǎn)基因大腸桿菌對(duì)重金屬Cd、Ni和Cu的耐受性

在正常條件下，Petg10A+GCS-GS轉(zhuǎn)化菌和野生對(duì)照菌的生長(zhǎng)勢(shì)幾乎沒有差別，如圖4(a)所示。在加入不同的重金屬后，兩個(gè)菌株的生長(zhǎng)勢(shì)出現(xiàn)了差異。在不同濃度的CdCl2脅迫下，轉(zhuǎn)化菌和對(duì)照菌的生長(zhǎng)都受到抑制，但隨著CdCl2濃度的增加，兩者的耐受差異逐漸增大，當(dāng)濃度為1mM時(shí)，差異最明顯，如圖4(b)所示，轉(zhuǎn)化菌的數(shù)量幾乎是對(duì)照菌的2倍。在NiSO4存在條件下，當(dāng)NiSO4濃度較低時(shí) (1mM)，兩者的生長(zhǎng)勢(shì)無明顯差別。當(dāng)NiSO4濃度為2mM時(shí)，兩者的耐受差異最明顯，如圖4(c)所示，轉(zhuǎn)化菌的數(shù)量約是對(duì)照菌的2倍。在CuCl2的濃度分別為0.5 mM、1.5 mM、3 mM和5 mM時(shí)，兩者的生長(zhǎng)勢(shì)無明顯差別。以上結(jié)果表明，嗜熱菌StGCS-GS基因的表達(dá)對(duì)大腸桿菌在Cd、Ni脅迫下的生長(zhǎng)發(fā)揮重要作用。

3 討論

圖4 轉(zhuǎn)StGCS-GS基因的大腸桿菌在重金屬脅迫條件下的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of StGCS-GS-expressing E.coli cells to heavy metal stress

Cd、Ni對(duì)大腸桿菌的毒害作用主要是使其細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的過氧化物，從而引起氧化脅迫［13］。目前，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)主要存在3種重金屬抗性機(jī)制。一是通過外排機(jī)制來限制細(xì)胞內(nèi)的重金屬濃度。二是與含有巰基的復(fù)合物相結(jié)合。三是改變重金屬離子的氧化態(tài)，降低其毒性［1］。大量文獻(xiàn)記載，植物中也同樣存在這些重金屬耐受機(jī)制［13］。GSH作為一種抗氧化劑直接參與逆境脅迫產(chǎn)生的活性氧簇的還原。而且能夠絡(luò)合重金屬，在細(xì)胞內(nèi)重金屬的解毒起重要作用。大量研究表明，通過在植物中過量表達(dá)GSH合成相關(guān)的基因，能夠提高其對(duì)重金屬的抗性。除真核生物之外，細(xì)菌也依靠細(xì)胞內(nèi)的GSH來抵御重金屬毒害。自身不能合成GSH的細(xì)菌也會(huì)利用胞外的GSH或胞內(nèi)其他的巰基化合物如谷氨酰半胱氨酸 (γ-EC)來替代GSH［14］。本文向大腸桿菌中轉(zhuǎn)化StGCS-GS基因，得到了與Verena等［6］人相似的研究結(jié)果，過量表達(dá)嗜熱鏈球菌 (S.thermophilus)的谷胱甘肽雙功能合成酶基因提高了大腸桿菌對(duì)重金屬Cd的抗性。為進(jìn)一步研究該基因在其他重金屬脅迫下的功能，本文又研究了過量表達(dá)該基因的大腸桿菌在Ni、Cu脅迫下的耐受性。結(jié)果表明，過量表達(dá)該基因提高了對(duì)Ni的耐受性，對(duì)Cu的耐受性卻沒有提高。推測(cè)原因可能是在這種遺傳背景下，GSH可能不是抵抗Cu脅迫所必需的。

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