陳圖剛 譚維羚 馬戰(zhàn)清 鐘志英 孫國鋒 周宇昕

（南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院 江西南昌330003）

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞 (endothelial progenitor cells,EPCs)是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞。新近研究表明血管內(nèi)皮祖細(xì)胞不僅參與胚胎期的血管發(fā)育，也存在于成年機(jī)體的骨髓及外周血中，在成體血管新生中起重要作用[1]。在組織損傷、缺血或梗死灶中有骨髓來源的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞聚集，并在原位分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞形成新的血管。這一重大發(fā)現(xiàn)為缺血性疾病的治療提供了新的方法。本實(shí)驗(yàn)采用犬外周血血管內(nèi)皮祖細(xì)胞體外擴(kuò)增后，在超聲引導(dǎo)下，經(jīng)皮穿刺行心肌梗死犬心外膜下移植EPCs，觀察其對(duì)急性心肌梗死后心肌再生及心功能改變的影響，并評(píng)價(jià)移植的效果及安全性，以探索促進(jìn)組織或器官血管新生的新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性家犬麻醉后平臥于設(shè)有大型X線機(jī)手術(shù)臺(tái)上，經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈穿刺置入6F動(dòng)脈鞘管，經(jīng)股動(dòng)脈彈丸式注入肝素鈉2 500 U，后每隔1 h追加肝素鈉1 250 U。用經(jīng)塑型的冠脈指引導(dǎo)管行冠脈造影，造影后置入PTCA球囊導(dǎo)絲，在導(dǎo)絲指引下置入2.5 mm×20 mm球囊至前降支前中段交界處以4～6 atm打開球囊堵塞冠脈，造影示球囊遠(yuǎn)端血流中斷。球囊保持充盈90 min，此間持續(xù)監(jiān)測壓力及電活動(dòng)。術(shù)后每天肌肉注射青霉素160萬U，持續(xù)3 d。

1.2 犬EPCs培養(yǎng)、鑒定

1.2.1 EPCs的采集、分離和培養(yǎng) 犬心肌梗死2周后，采用密度梯度離心法從外周血獲得單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上。M199培養(yǎng)基（含20%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL）培養(yǎng)4 d，用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7 d，用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2 EPCs的 鑒 定 細(xì)胞與 acLDL-Dil（2.4 μg/mL）37℃下孵育1 h以檢測EPCs對(duì)DiLDL的攝取。然后用2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。固定后用 PBS浸洗，將FITC-UEA-Ⅰ（10 g/mL）加于上述標(biāo)本于37℃下孵育1 h。激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope,LSCM,Leica）鑒定FITC-UEA-I和Dil-acLDL雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs，在倒置熒光顯微鏡下對(duì)每孔計(jì)數(shù)。細(xì)胞表型檢測：用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將2×105貼壁細(xì)胞分別與PE標(biāo)記的VEGFR-2、AC133和CD34單克隆抗體在4℃孵育30 min后，用PBS洗細(xì)胞2次，最后用300 μL PBS懸浮細(xì)胞后于流式細(xì)胞儀上檢測。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及經(jīng)皮穿刺行心肌梗死犬心外膜下移植EPCs 犬心肌梗死模型手術(shù)后4周，再次經(jīng)肌肉注射氯胺酮（5 mg/kg）和速眠新（0.08 mL/kg）誘導(dǎo)麻醉，將動(dòng)物平臥于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，隨機(jī)分成兩組行細(xì)胞移植術(shù)，一組為對(duì)照組，注入2 mL生理鹽水（n=6）；另一組注入 2 mL EPCs（n=6）。左心前區(qū)皮膚消毒，鋪無菌巾，二維超聲心動(dòng)圖直引下，穿刺心外膜下心肌，監(jiān)測電極顯示ST段抬高，即注入細(xì)胞懸液0.2 mL，改變不同方向，每一點(diǎn)分別注射0.2 mL生理鹽水或EPCs懸液，共10點(diǎn)。注射中均可見室性期前收縮及短陣室速，注射停止則期前收縮消失。

1.4 梗死心肌組織內(nèi)微血管計(jì)算 梗死區(qū)心肌石蠟包埋的組織切片采用CD34免疫組化染色。CD34定位于內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，顯示棕黃色或棕褐色，每份標(biāo)本均選3個(gè)低倍視野（200×）、計(jì)數(shù)每個(gè)低倍視野的微血管數(shù)，取3個(gè)低倍視野微血管數(shù)為該份標(biāo)本的平均微血管密度（MMVC）。

1.5 心肌梗死面積測量 移植后8周，開胸取出心臟，剪除雙側(cè)心房、右心室，沿左心室長軸由心尖到心底部做2 mm厚切片，共切5片。沖洗后，置于1%TTC溶液（以0.2M HCl，pH=7.8為緩沖液）中，37℃水浴箱中熱浴15 min后，顯示存活的心肌染成紅色，壞死心肌為白色。用TJTY-400型多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，該系統(tǒng)自動(dòng)測量出每層的心肌梗死面積占總面積的百分比。每層梗死心肌的容積=每層面積×厚度（2 mm），將5張切片中每層梗死心肌容積相加即為整個(gè)心肌的梗死面積（%）。

1.6 超聲心動(dòng)圖心功能檢查 于細(xì)胞移植術(shù)1、2、4、8周后行超聲心動(dòng)圖檢查，測量左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

2 結(jié)果

2.1 梗死區(qū)心肌微血管數(shù)量（血管密度）檢測 各個(gè)時(shí)段移植組梗死區(qū)血管密度明顯高于對(duì)照組，且隨著移植觀察時(shí)間的延長，血管密度逐漸增加。見表1。

表1 兩組梗死心肌血管密度比較 (±S) 個(gè)/視野

表1 兩組梗死心肌血管密度比較 (±S) 個(gè)/視野

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別 1周 2周 4周 8周對(duì)照組 75.58±6.59 86.32±7.54 97.48±7.47 105.93±8.16內(nèi)皮祖細(xì)91.13±8.65*111.65±13.76**129.87±15.31**141.46±15.86**胞移植組

2.2 心肌梗死面積測量 移植1、2、4、8周后梗死心肌面積明顯小于對(duì)照組（P＜0.01），且隨移植觀察時(shí)間的延長，梗死心肌面積逐漸減少。內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組梗死心肌瘢痕邊緣毛細(xì)血管密度明顯高于對(duì)照組。見表2。

表2 兩組心肌梗死面積的比較 (±S) cm2

表2 兩組心肌梗死面積的比較 (±S) cm2

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別 1周 2周 4周 8周對(duì)照組 10.71±0.73 10.15±0.54 9.56±0.64 8.67±0.53內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組 9.90±0.93* 8.81±0.71* 7.76±0.63**6.55±0.68**

2.3 左室射血分?jǐn)?shù) 應(yīng)用超聲心動(dòng)圖檢測心功能，內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組的左室射血分?jǐn)?shù)較對(duì)照組明顯提高(P＜0.01)，且隨移植觀察時(shí)間的延長，左室射血分?jǐn)?shù)逐漸升高。見表3。

表3 兩組LVEF比較 (±S)

表3 兩組LVEF比較 (±S)

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別 1周 2周 4周 8周對(duì)照組 0.38±0.09 0.40±0.07 0.41±0.09 0.44±0.10內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組 0.39±0.11 0.43±0.08* 0.48±0.09**0.53±0.12**

3 討論

缺血性心臟病是臨床常見的疾病，盡管經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG）、激光心肌血運(yùn)重建術(shù)等已得到廣泛應(yīng)用，但仍有部分患者不適合或無效，無法重建血運(yùn)。近年來人們提出了血管形成(angiogenesis)治療方法來重建血運(yùn)。治療性心肌血管新生(therapeutic angiogenesis)是指應(yīng)用藥物、基因治療或其它治療手段刺激心肌缺血區(qū)小血管生長和側(cè)支循環(huán)形成，達(dá)到改善心肌缺血的目的[2]。這給冠心病，特別是不適宜PTCA、CABG,藥物治療效果又欠佳者帶來希望。促進(jìn)血管新生是治療冠心病的理想方法，一般可通過以下四個(gè)途徑達(dá)到目的：（1）局部應(yīng)用促血管新生的多肽生長因子；（2）轉(zhuǎn)染血管新生的基因；（3）開發(fā)心內(nèi)膜的小通道，以增加從左室腔向心肌流向的血流通道；（4）局部血管應(yīng)用干（祖）細(xì)胞[2～3]。

心血管疾病時(shí)血管新生主要發(fā)生在缺血性心血管病，此時(shí)其代償主要靠側(cè)枝循環(huán)的建立(collateral vessel recruitment)[4]。但是機(jī)體內(nèi)源性側(cè)枝循環(huán)的代償是很有限的，極少能完全補(bǔ)償因血管閉塞而造成之血流量減少，因此近年出現(xiàn)了促血管新生治療或稱治療性血管新生[5～6]。本實(shí)驗(yàn)顯示自體血管內(nèi)皮祖細(xì)胞移植1、2、4、8周后梗死區(qū)血管密度高于對(duì)照組（P＜0.01），且隨移植觀察時(shí)間的延長，血管密度逐漸增加。移植1、2、4、8周后梗死心肌面積明顯小于對(duì)照組（P＜0.01），且隨移植觀察時(shí)間的延長，梗死心肌面積逐漸減少。內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組梗死心肌瘢痕邊緣毛細(xì)血管密度明顯高于對(duì)照組。內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組的左室射血分?jǐn)?shù)較對(duì)照組明顯提高（P＜0.01），且隨移植觀察時(shí)間的延長，左室射血分?jǐn)?shù)逐漸升高。可見自體血管內(nèi)皮祖細(xì)胞移植到心肌梗死犬缺血心肌后能分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)梗死后心肌血管新生及心肌修復(fù)，改善心功能。

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