呂 舟

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 吉林 132000）

牛瑟氏泰勒蟲病是由泰勒科、泰勒屬的瑟氏泰勒蟲（Theileria.sergenti）寄生于牛體內(nèi)引起的以高熱、貧血、出血、消瘦和體表淋巴結(jié)腫大為主要臨床癥狀的一種血液原蟲病[1－2]。該病呈世界性分布，我國東北、西北、華北、華南等地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲感染情況較嚴(yán)重[3－7]。近年來，隨著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，牛瑟氏泰勒蟲病的發(fā)生呈上升趨勢勢尤其是引進(jìn)牛和改良牛的發(fā)病率和致死率均較高，已成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一。

硬蜱（Ixoaldae）是家畜多種傳染病和寄生蟲病的傳播者，特別對家畜血孢子蟲病病原的傳播起著重要作用[8]。該蟲體寄生于牛、羊體表，吸食血液，引起家畜消瘦，更為嚴(yán)重的是，蜱是焦蟲病、立克次氏體病等的傳播者[9]。其中硬蜱隸屬硬蜱科血蜱屬的長角血蜱為牛瑟氏泰勒蟲的傳播媒介[10]。通過叮咬，將病牛的感染紅細(xì)胞吸入，經(jīng)蜱體內(nèi)發(fā)育，再叮咬時(shí)，將正在分裂的焦蟲注人另一宿主（病牛）體內(nèi)，并繼續(xù)吸入感染的紅細(xì)胞[11]。針對蜱這一傳播媒介，本試驗(yàn)對其DNA含量進(jìn)行了分析，比較其與牛瑟氏泰勒蟲基因組DNA含量及P33表面蛋白基因同源性，進(jìn)一步證明其傳播途徑及確定含量關(guān)系，為焦蟲病、立克次氏體病等病基因組DNA的提取提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病料及主要試劑

在牛瑟氏泰勒蟲病的高峰期6～7月，于吉林省延邊州琿春市某牧場采集樣本。?？鼓杭拔篁鐚?yīng)在同一頭牛身上被采集，每頭做標(biāo)記。DNA提取試劑盒、exTaq酶等均購自TaKaRa公司，其他試劑為分析純。

1.2 涂片的制備

取血液樣本涂片、自然干燥，滴加甲醇2～3滴，固定2～3min。將固定片浸于盛有姬姆薩染色液的染缸中染30min，然后水洗、干燥、顯微鏡觀察。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

據(jù)GenBank（AF521557.1）上發(fā)表的牛瑟氏泰勒蟲P33表面蛋白基因序列，應(yīng)用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為：P1：5－atgttgtccaagaaatcgtt－3′ ，P2：5－cagtattctactatctctag－3 ′，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為852 bp。

1.4 牛瑟氏泰勒蟲基因組DNA的提取及目的片段擴(kuò)增

用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以其為模板，采用25μL PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μL， dNTP 2μL，P1、P2引物各1μL，模板DNA 2 μL，exTaq酶 0.25 μL，dH2O 16.25 μL。PCR反應(yīng)條件為35個(gè)循環(huán)，94℃預(yù)變性5min，94℃ 45 s，55℃ 1min，72℃ 1min，72℃ 延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 紫外分光光度計(jì)法測DNA含量

將樣品進(jìn)行50倍稀釋后，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)，在波長為260及280 nm下調(diào)零，并測定其OD值，依據(jù)測定結(jié)果計(jì)算其DNA濃度含量。

計(jì)算公式見式（1）

注：濃度單位為μg·mL－1。

1.6 同源性比較

將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，通過軟件DNAMAN，對GenBank上登錄的基因序列與牛瑟氏泰勒蟲延邊州分離株的兩個(gè)樣本的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 涂片鏡檢的結(jié)果

涂片鏡檢結(jié)果見圖1。

圖1 姬姆薩染色涂片鏡檢結(jié)果

由圖1可見，鏡檢發(fā)現(xiàn)兩種血液樣本中紅細(xì)胞形狀大小不一，紅細(xì)胞內(nèi)有小型蟲體，呈梨籽形和逗點(diǎn)形等形狀，A圖中蟲體的染蟲率約為15%，B圖蟲體的染蟲率約為4%。可見蜱吸血后血液中牛瑟斯泰勒蟲明顯高于牛血液中染蟲率。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以兩種牛瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模板，P1、P2為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

由圖2可見，在852 bp擴(kuò)增出特異性條帶，并可明顯看出蜱吸血后血液擴(kuò)增條帶比牛血液擴(kuò)增條帶清楚得多。與預(yù)期結(jié)果相一致。

圖2 PCR鑒定結(jié)果

2.3 紫外分光光度計(jì)法測DNA含量

透過紫外分光光度計(jì)測量后，經(jīng)公式計(jì)算，結(jié)果在蜱吸血后血液DNA濃度為127 ug·mL－1，而牛血液中DNA濃度僅為52 ug·mL－1。結(jié)果顯示蜱吸血后血液DNA濃度明顯高于血液中DNA濃度。

2.4 同源性比較

測序結(jié)果表明，牛血液中和蜱吸血后血液中該基因序列同源性為100%。兩者與GenBank上已發(fā)表的序列同源性為99%，由此可見該基因在蜱吸血后血液中和牛血液中具有相同的序列，進(jìn)一步證明蜱是牛瑟氏泰勒蟲病的傳播媒介。

3 討論

近年來，隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展和牛只的頻繁運(yùn)輸，瑟氏泰勒蟲病的發(fā)生呈上升趨勢，且疫區(qū)發(fā)病率和致死率均較高，給畜牧業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了國內(nèi)外獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。因此對瑟氏泰勒蟲病的研究已迫在眉睫。蜱是瑟氏泰勒蟲是傳播媒介，已知能傳播瑟氏泰勒蟲蜱有長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）、嗜群血蜱（H.concinna）和日本血蜱（H.japonica）3種，我國主要是長角血蜱。

DNA是主要的遺傳物質(zhì)，而遺傳物質(zhì)的基本功能是遺傳信息的傳遞和表達(dá)，所以對DNA的來源及含量的測定有著極其重要的意義。本試驗(yàn)通過DNA試劑盒在牛血液中和蜱吸血后血液中分別提取出基因組DNA，通過DNA試劑盒法替代傳統(tǒng)的乙醇沉淀法提取基因組DNA，可得到高質(zhì)量的不含苯酚、氯仿、乙醇等化學(xué)試劑的基因組DNA，并盡可能避免在傳統(tǒng)乙醇沉淀過程中因DNA沉淀不完全而導(dǎo)致的DNA損耗，獲取最大量的基因組DNA。

通過姬姆薩染色法、PCR鑒定、紫外分光光度計(jì)法可初步判定蜱吸血后血液中基因組DNA要明顯高于牛血液。測序結(jié)果表明，牛血液中和蜱吸血后血液中該基因序列同源性為100%。兩者所得序列經(jīng)BLAST對GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的牛瑟氏泰勒蟲P33主要表面蛋白基因序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果為99.0%，這表明所擴(kuò)增產(chǎn)物是P33蛋白基因序列，與預(yù)期結(jié)果相符。進(jìn)一步證明蜱是牛瑟氏泰勒蟲病的傳播媒介。為今后牛瑟氏泰勒蟲病的研究及對蜱這一傳播媒介的深入探討提供理論依據(jù)。

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