摘要：從蘇云金芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｔ０４Ａ００１中提取基因組ＤＮＡ，通過ＰＣＲ的方法克隆了幾丁質(zhì)酶ｃｈｉＡＣ基因（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＥＦ４２７６７０）。置換ｃｈｉＡＣ基因的啟動(dòng)子為Ｔ７啟動(dòng)子時(shí)，ｃｈｉＡＣ基因能在ＩＰＴＧ誘導(dǎo)下在大腸桿菌中大量表達(dá)，并產(chǎn)生大小約７０ ｋＤａ的表達(dá)產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；幾丁質(zhì)酶基因；克??；序列分析；表達(dá)

中圖分類號：Ｑ７８６文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0599-04

Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ

Ｔ０４Ａ００１ Ｓｔｒａｉｎ

ＣＡＩ Ｙａ－ｊｕｎ1，2，ＹＵＡＮ Ｚｈｉ－ｍｉｎｇ2，ＨＵ Ｘｉａｏ－ｍｉｎ2，ＣＡＩ Ｑｕａｎ－ｘｉｎ2

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｕｈａｎ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７３，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，The Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓciences，Ｗｕｈａｎ ４３００７１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉＡＣ（GenBank Accession Number：EF427670） ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｔ０４Ａ００１ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉＡＣ ｕｎｄｅｒ Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ； ａｎｄ ｉｔ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｏｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ７０ ｋＤａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ； ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ； ｃｌｏｎe； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

幾丁質(zhì)酶在芽孢桿菌中廣泛存在，目前已有多種芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶基因得到了克隆與表達(dá)，如環(huán)狀芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、蠟狀芽孢桿菌（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）、蘇云金芽孢桿菌（Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，簡稱Ｂｔ）、枯草芽孢桿菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）以及地衣芽孢桿菌（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等［１，２］。蘇云金芽孢桿菌因?yàn)閷Χ喾N害蟲具有毒殺作用而一直為人們所關(guān)注，目前已有十多個(gè)亞種的蘇云金芽孢桿菌被證明能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶［３］。有報(bào)道證明，蘇云金芽孢桿菌自身產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對其殺蟲毒力具有增效作用，其殺蟲毒力與幾丁質(zhì)酶的活力呈高的正相關(guān)（０．７５～０．７９）［４］，表明幾丁質(zhì)酶在外界因素對害蟲的侵害中起著重要的作用。增加外源的幾丁質(zhì)酶可以提高蘇云金芽孢桿菌殺蟲效果，而用阿洛菌素（一種幾丁質(zhì)酶抑制劑）抑制蘇云金芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶后，ＬＣ５０值增高［５］。因此，對蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的性質(zhì)、編碼基因的序列差異性以及幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)等方面進(jìn)行研究，可為幾丁質(zhì)酶更好的應(yīng)用于生物防治提供依據(jù)。

本研究對產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力高的Bt菌株Ｔ０４Ａ００１［６］的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了克隆、測序分析，并將Ｔ０４Ａ００１菌株的幾丁質(zhì)酶基因ｃｈｉＡＣ的開放閱讀框（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）在Ｔ７啟動(dòng)子調(diào)控下進(jìn)行原核表達(dá)。幾丁質(zhì)酶基因的序列測定及其在大腸桿菌中的大量表達(dá)為研究芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的進(jìn)化關(guān)系、幾丁質(zhì)酶的純化與制備及更進(jìn)一步研究提供了條件。

１材料與方法

１．１菌株與培養(yǎng)基

Bt菌株Ｔ０４Ａ００１為本實(shí)驗(yàn)室分離保藏，大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、ＢＬ２１為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。ＬＢ培養(yǎng)基（每升含１０ ｇ蛋白胨，５ ｇ酵母粉，１０ ｇ ＮａＣｌ）；氨芐青霉素和卡那霉素使用終濃度分別為５０ μｇ／ｍＬ和３０ μｇ／ｍＬ，ＩＰＴＧ 使用終濃度為

１ ｍｍｏｌ／Ｌ。

１．２主要試劑與儀器

所用內(nèi)切酶均購自ＴａＫａＲａ公司；質(zhì)粒提取、ＰＣＲ產(chǎn)物回收和ＤＮＡ片段快速純化試劑盒購自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ公司；Ｈｉｓ－bｉｎｄ親和層析蛋白純化試劑盒購自Ｎｏｖａｇｅｎ公司；其余常規(guī)試劑均為Ｓｉｇｍａ進(jìn)口分裝。主要儀器有美國Ｂｉｏｔｅｃｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ全波長自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國ＡＢＩ ９８００ ＰＣＲ儀，電泳系統(tǒng)為美國ＢｉｏＲａｄ ＤＮＡ電泳系統(tǒng)和蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)。

１．３ＤＮＡ的提取

大腸桿菌質(zhì)粒ＤＮＡ提取參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版（１９89）小量堿法進(jìn)行［７］。

芽孢桿菌的總ＤＮＡ按照如下方法提取。將芽孢桿菌單菌落接入ＬＢ培養(yǎng)基中，３０℃ ２００ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)４～５ ｈ至ＯＤ６００約０．６～０．８，取１．５ ｍＬ菌液至Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，離心收集菌體，用ＴＥＳ緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ值為８．０，５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ值為８．０，２０％蔗糖）洗滌菌體１次，沉淀中加入５００ μＬ含１０ ｍｇ／ｍＬ溶菌酶的ＴＥＳ，混勻后３７℃下作用１．０～１．５ ｈ至菌體形成原生質(zhì)球，加１００ μＬ １０％ ＳＤＳ溶液及終濃度為２ ｍｇ／ｍＬ的蛋白酶Ｋ，上下顛倒數(shù)次混勻，３７℃下作用１ ｈ，１２ ０００ r／min離心１０ ｍｉｎ，上清加等體積的酚氯仿抽提后，加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇溫和混勻，－２０℃放置３０ ｍｉｎ左右后１２ ０００ r／min離心１０ ｍｉｎ，沉淀用７０％乙醇洗滌，風(fēng)干，最后溶于含２ ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ酶的適量的無菌去離子水中。

１．４幾丁質(zhì)酶基因的ＰＣＲ擴(kuò)增

根據(jù)ＧｅｎＢａｎｋ中Ｂｔ以色列亞種幾丁質(zhì)酶基因（ＧｅｎＢａｎｋ序列號為ＡＦ５２６３７９）全序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增引物［８］，ＩＣＨＩ１ ５′－ＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＴＡＣＣＡ－３′（帶ＳａｌⅠ酶切位點(diǎn)），ＣＣＨＩ１ ５′－ＧＧＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＣ－３′（帶ＥｃｏＲⅠ酶切位點(diǎn)），ＣＣＨＩ２ ５′－ＧＧＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＣ－３′（帶ＨｉｎｄⅢ酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增體系為：芽孢桿菌總ＤＮＡ ０．１ μｇ，１×ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ， ２．５ ｐｍｏｌ ｄＮＴＰｓ，

Ｔａｑ ｐｌｕｓ（Ｔａｑ＋ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１ Ｕ，引物各

１０ ｐｍｏｌ，加ｄｄＨ２Ｏ至２５ μＬ。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；９４℃變性３０ ｓ，５０℃退火３ ｍｉｎ，７２℃延伸３ ｍｉｎ，２８個(gè)循環(huán)；７２℃延伸７ ｍｉｎ。

１．５幾丁質(zhì)酶基因的克隆

以Bt菌株Ｔ０４Ａ００１總ＤＮＡ為模板，ＩＣＨＩ１／ＣＣＨＩ２為引物，ＰＣＲ擴(kuò)增得到包含啟動(dòng)子和ｃｈｉＡＣ基因ＯＲＦ和終止子的幾丁質(zhì)酶全長基因，將ＰＣＲ產(chǎn)物（為確保ＰＣＲ產(chǎn)物末端加上了Ａ殘基，擴(kuò)增完成后直接向ＰＣＲ反應(yīng)管中加入１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，７２ ℃延伸３０ ｍｉｎ），用ＰＣＲ產(chǎn)物回收試劑盒純化回收后連接到ＰＣＲ產(chǎn)物克隆載體ｐＭＤ１８－Ｔ上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α，在氨芐青霉素抗性ＬＢ平板上挑取白色克隆子，提取質(zhì)粒酶切鑒定，得到Ｔ０４Ａ００１幾丁質(zhì)酶基因的正確克隆子Ｅ－ｐＭＤＣ２６，送往上海博道生物公司測序。

１．６用于幾丁質(zhì)酶基因原核表達(dá)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以ＣＣＨＩ１／ＣＣＨＩ２為引物ＰＣＲ擴(kuò)增得到不含啟動(dòng)子序列的ｃｈｉＡＣ基因ＯＲＦ，其兩端分別帶有ＥｃｏＲⅠ和Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切位點(diǎn)，ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)ＰＣＲ產(chǎn)物回收試劑盒純化回收后ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ Ⅲ雙酶切。雙酶切后的ＰＣＲ片段與表達(dá)質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａ ＥｃｏＲⅠ／Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切后的片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α后在卡那霉素抗性ＬＢ平板上篩選克隆子，隨機(jī)挑取菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒即為ｃｈｉＡＣ基因在質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａ Ｔ７啟動(dòng)子控制下表達(dá)的重組質(zhì)粒，命名為ｐＥＴＣ２１。

１．７幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白質(zhì)純化

將質(zhì)粒ｐＥＴＣ２１轉(zhuǎn)化Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１，得到用于誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌株Ｅ－ｐＥＴＣ２１。Ｅ－ｐＥＴＣ２１接到

５ ｍＬ ＬＢ液體培養(yǎng)基中，３０℃震蕩培養(yǎng)（２００ ｒ／ｍｉｎ）過夜，按１∶１ ０００比例轉(zhuǎn)接到５００ ｍＬ的新鮮ＬＢ中，當(dāng)菌液培養(yǎng)至ＯＤ６００約０．６時(shí)加入終濃度為１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)４ ｈ，取樣處理后經(jīng)Ｈｉｓ－bｉｎｄ親和層析試劑盒純化得到表達(dá)的幾丁質(zhì)酶。具體純化方法見試劑盒說明?？捡R斯亮藍(lán)Ｇ２５０染色法測定純化的蛋白質(zhì)濃度。３，５－二硝基水楊酸測定幾丁質(zhì)酶活力［６］。一個(gè)酶活力單位（Ｕ）定義為合適溫度下每小時(shí)產(chǎn)生１ μｇ還原糖的酶量。

１．８抗血清制備和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析

約４００ ｎｇ的純化的ＣｈｉＡＣ蛋白質(zhì)經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離、考馬斯亮藍(lán)染液染色、脫色后，將７０ ｋＤａ目的蛋白帶切下，凍融３次，用研缽研碎，懸浮于１ ｍＬ生理鹽水中。蛋白樣品制備好后，注射兔子進(jìn)行免疫反應(yīng)。２周后加強(qiáng)一次注射免疫，１個(gè)月后再一次加強(qiáng)，１個(gè)半月后取兔血，離心得到７０ ｋＤａ ＣｈｉＡＣ的抗血清。制備Ｅ－ｐＥＴ２８ａ菌體破碎后的可溶性部分０．５ ｍＬ，與１０ ｍＬ抗血清在４℃孵育過夜，然后３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心３ ｍｉｎ，除去所有抗原抗體凝集反應(yīng)的沉淀，得到去除宿主菌雜抗體的抗血清。本研究經(jīng)摸索后確定Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析均用１ ０００倍稀釋度的ＣｈｉＡＣ抗血清進(jìn)行一抗雜交。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［７］進(jìn)行。

２結(jié)果

２．１幾丁質(zhì)酶基因和氨基酸序列分析

序列測定表明，Ｂｔ菌株Ｔ０４Ａ００１的幾丁質(zhì)酶基因編碼序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＥＦ４２７６７０）由２ ０３１個(gè)核苷酸組成，是編碼６７６個(gè)氨基酸的７４ ｋＤａ蛋白質(zhì)。與ＧｅｎＢａｎｋ中其他ＣｈｉＡ家族幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行核酸序列比對，菌株Ｔ０４Ａ００１（Ｈ４血清型）幾丁質(zhì)酶基因ｃｈｉＡＣ的全序列與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ（Ｈ１４血清型）幾丁質(zhì)酶基因ｉｃｈｉ相似性最高，為９９％；與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｏｎｋｕｋｉａｎ（Ｈ３４血清型）幾丁質(zhì)酶基因Ｂｔ及Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｎｙａｅ（Ｈ４ａ４ｃ血清型）幾丁質(zhì)酶基因ｃｈｉＡ７４相似９８％；與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｏｔｔｏ（Ｈ４ａ４ｂ血清型）幾丁質(zhì)酶基因Ｂｔｓ相似９６％；與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｐａｋｉｓｔａｎｉ（Ｈ１３血清型）幾丁質(zhì)酶基因ｃｈｉＡ７１相似８０％；與枯草芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶基因Ｂｓｕ相似４２％；與地衣芽孢桿菌ＴＰ菌株幾丁質(zhì)酶基因Ｂl相似２８％；與Ｓ． ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ菌株１４１ 幾丁質(zhì)酶基因Ｓｍ相似７％（見圖１）。

將ｃｈｉＡＣ翻譯得到的蛋白序列ＣｈｉＡＣ與ＧｅｎＢａｎｋ中其他Ｂｔ菌株的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行比對，結(jié)果顯示ＣｈｉＡＣ與其他Ｂｔ菌株的幾丁質(zhì)酶存在高度相似性，與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｐａｋｉｓｔａｎｉ幾丁質(zhì)酶ＣｈｉＡ７１相似性為７０％，與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｏｎｋｕｋｉａｎ幾丁質(zhì)酶Bt相似性為９３％，與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉsｒａｅｌｅｎｓｉｓ及同為Ｈ４血清型的Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｏｔｔｏ幾丁質(zhì)酶相似性為９７％，與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｎｙａｅ幾丁質(zhì)酶ＣｈｉＡ７４相似性則有９９％。這些Ｂｔ菌株的幾丁質(zhì)酶均屬于糖基水解酶１８家族，且同為ＣｈｉＡ。

在ＣｈｉＡＣ的Ｎ端，首先是一段３４氨基酸的信號肽，該信號肽能被革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及其他原核生物識(shí)別，在革蘭氏陰性菌中其斷裂位點(diǎn)是Ｌｅｕ－３３和Ａｌａ－３４，在革蘭氏陽性菌和其他原核生物中其斷裂位點(diǎn)是Ａｌａ－３４和Ａｓｐ－３５。其后為催化區(qū)，該結(jié)構(gòu)域在Ｂｔ菌株的幾丁質(zhì)酶中高度保守，與幾丁質(zhì)酶活性相關(guān)的Ａｓｐ－２０７、Ａｓｐ－２０９和Ｇｌｕ－２１１高度保守。催化區(qū)之后為兩個(gè)纖粘蛋白相似區(qū)（Ｆｂｒｏｎｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ，ＦＬＤ），盡管兩個(gè)ＦＬＤ相互之間相似性很低（１０％左右），但均含有粘蛋白的典型保守氨基酸殘基（ＦＬＤ１：Ｔｒｐ－３７３、Ｔｙｒ－３８４和Ｔｙｒ－４１１；ＦＬＤ２：Ｔｒｐ－５０７、Ｔｙｒ－５１９和Ｔｙｒ－５４６）。在Ｂｔ菌株的幾丁質(zhì)酶中，僅巴基斯坦亞種幾丁質(zhì)酶不含ＦＬＤ１，其余幾丁質(zhì)酶ＦＬＤｓ的相似性均達(dá)到９０％以上。在ＦＬＤｓ之后為位于Ｃ端的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)，其保守殘基為Ｔｒｐ－５９１、Ｔｙｒ－5９５和Ｔｒｐ－6２６，Ｂｔ菌株的幾丁質(zhì)酶的該結(jié)構(gòu)域相似性也均達(dá)到９０％以上。

２．２ｃｈｉＡＣ基因在Ｔ７啟動(dòng)子下的表達(dá)

幾丁質(zhì)酶基因ｃｈｉＡＣ ＯＲＦ插入載體ｐＥＴ２８ａ，得到ｃｈｉＡＣ基因ＯＲＦ在Ｔ７啟動(dòng)子調(diào)控下的重組表達(dá)質(zhì)粒ｐＥＴＣ２１，轉(zhuǎn)進(jìn)Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１中，得到重組菌株Ｅ－ｐＥＴＣ２１。對Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ－ｐＥＴ２８ａ、Ｅ－ｐＥＴＣ２１全菌體和純化的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析，原始菌株Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１和轉(zhuǎn)化空載體的對照菌株Ｅ－ｐＥＴ２８ａ均不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，而Ｅ－ｐＥＴＣ２１及由其所提取的幾丁質(zhì)酶均能觀察到ＣｈｉＡＣ蛋白質(zhì)對應(yīng)的７０ ｋＤａ表達(dá)帶，同時(shí)還可觀察到兩條大小分別約４０ ｋＤａ和２９ ｋＤａ的降解蛋白質(zhì)條帶（圖２）。

２．３在Ｅ－ｐＥＴＣ２１中的表達(dá)時(shí)相分析

同時(shí)接種兩瓶Ｅ－ｐＥＴＣ２１培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)４ ｈ時(shí)ＯＤ６００均達(dá)到約０．６，此時(shí)在一個(gè)搖瓶中加入１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ繼續(xù)培養(yǎng)，另一瓶則不加ＩＰＴＧ用作對照。由圖３可知，在加入ＩＰＴＧ誘導(dǎo)后菌株的生長明顯受到抑制，菌體ＯＤ６００最高僅能達(dá)到０．８左右，而未加ＩＰＴＧ誘導(dǎo)的菌體ＯＤ６００可達(dá)到１．１左右。誘導(dǎo)后菌株的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量顯著增強(qiáng)，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長不斷增長，直至培養(yǎng)１００ ｈ左右酶活最高可達(dá)到約４２０ Ｕ／ｍＬ，之后酶活逐漸下降；而未誘導(dǎo)的Ｅ－ｐＥＴＣ２１雖然也能表達(dá)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，但其產(chǎn)量不高，酶活最高僅能達(dá)到１００ Ｕ／ｍＬ。

３討論

本研究所克隆的Bt菌株Ｔ０４Ａ００１的幾丁質(zhì)酶基因ｃｈｉＡＣ包括啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止子序列，其編碼區(qū)由分泌信號肽、催化區(qū)、ＦＬＤｓ和幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)４個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。蛋白質(zhì)前體的信號肽符合原核生物信號序列特點(diǎn)，即Ｎ末端帶電荷，其后形成一個(gè)疏水中心以及極性氨基酸串。成熟的ＣｈｉＡＣ蛋白質(zhì)的Ｎ端存在一個(gè)催化區(qū)，與糖基水解酶１８家族的催化區(qū)有較高的同源性，其中Ｄ２０７、Ｄ２０９、Ｅ２１１高度保守，可能是質(zhì)子供體。催化區(qū)后有兩個(gè)與Ｆｎ Ⅲ結(jié)構(gòu)域有同源性的區(qū)域——ＦＬＤｓ。該結(jié)構(gòu)域?qū)锥≠|(zhì)酶與幾丁質(zhì)的結(jié)合作用無影響，卻與膠狀幾丁質(zhì)降解程度有關(guān)。目前已在Ｂａｃｉｌｌｕｓ sp.、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ sp.等細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶中發(fā)現(xiàn)了ＦｎⅢ同源結(jié)構(gòu)域。除幾丁質(zhì)酶外，α－淀粉酶、纖維素酶、ＰＨＢ解聚酶等也存在ＦｎⅢ同源結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)行氨基酸序列比對時(shí)發(fā)現(xiàn)，在其他結(jié)構(gòu)域高度相似的情況下，同時(shí)具有ＦＬＤ１和ＦＬＤ２的Ｂｔ菌株的幾丁質(zhì)酶ＣｈｉＡ７４為內(nèi)切酶，而缺少ＦＬＤ１區(qū)域的ＣｈｉＡ７１卻為外切酶，因此推測ＦＬＤ１可能影響了幾丁質(zhì)酶的水解切口部位，同時(shí)推測與ＣｈｉＡ７４相似度達(dá)９９％且具有ＦＬＤ１的ＣｈｉＡＣ也為內(nèi)切酶。ＣｈｉＡＣ蛋白Ｃ端幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)中的芳香族氨基酸——酪氨酸（Ｔｙｒ）和色氨酸（Ｔｒｐ）也是高度保守的，該結(jié)構(gòu)域能特異結(jié)合不可溶幾丁質(zhì)（如膠狀幾丁質(zhì)或再生幾丁質(zhì)）及晶體幾丁質(zhì)，卻不能與可溶性幾丁質(zhì)及其他不溶性多糖結(jié)合。

幾丁質(zhì)酶基因ｃｈｉＡＣ在載體ｐＥＴ２８ａ的Ｔ７啟動(dòng)子調(diào)控下能夠誘導(dǎo)表達(dá)，雖然其自身具有較高的本底表達(dá)水平，但在ＩＰＴＧ誘導(dǎo)下，幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量能夠得到顯著且迅速的提高。表達(dá)的幾丁質(zhì)酶在胞內(nèi)和胞外都能檢測到。對菌體進(jìn)行時(shí)相ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析顯示，在３７℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，加入１ ｍmol／L ＩＰＴＧ后的最初２ ｈ內(nèi)可觀察到逐漸增強(qiáng)的７０ ｋＤａ表達(dá)蛋白質(zhì)條帶，但之后繼續(xù)培養(yǎng)，則表達(dá)帶的強(qiáng)度保持不變（數(shù)據(jù)未顯示）。對比酶活時(shí)相檢測誘導(dǎo)后酶活不斷增強(qiáng)的結(jié)果，表明在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的幾丁質(zhì)酶主要分泌到了胞外。此外，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析中，重組菌株在表達(dá)產(chǎn)生７０ ｋＤａ幾丁質(zhì)酶ＣｈｉＡＣ的同時(shí)還產(chǎn)生兩條大小分別為４０ ｋＤａ左右和２９ ｋＤａ左右的蛋白質(zhì)條帶，推測它們是７０ ｋＤａ ＣｈｉＡＣ的降解產(chǎn)物。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 馮波． 微生物幾丁質(zhì)酶的研究概況［Ｊ］． 天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），１９９８，１８（３）：５０－５６．

［２］ 馮俊麗，朱旭分． 微生物幾丁質(zhì)酶的分子生物學(xué)研究［Ｊ］． 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），２００４，３０（１）：１０２－１０８．

［３］ 盧偉，蔡峻，陳月華．蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展［Ｊ］． 微生物學(xué)通報(bào)，２００７，３４（１）：１４３－１４７．

［４］ 邱立友．微生物幾丁質(zhì)酶與害蟲防治［Ｊ］．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，１９９５， ２９（２）：１８４－１９１．

［５］ ＳＡＭＰＳＯＮ Ｍ Ｎ，ＧＯＯＤＡＹ Ｇ Ｗ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔｓ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，１４４（８）：２１８９－２１９４．

［６］ ＬＩＵ Ｍ，ＣＡＩ Ｑ Ｘ，ＬＩＵ Ｈ Ｚ，ｅｔ ａｌ． Ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｌａｒｖｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］． Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，９３（３）：３７４－３７９．

［７］ ＳＡＭＢＲＯＯＫ Ｊ，ＦＲＩＴＳＣＨ Ｅ Ｆ，ＭＡＮＩＡＴＩＳ Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ cｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ［Ｍ］． Second edition. New York：Ｃｏｌｄ Sｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９89．

［８］ ＺＨＯＮＧ Ｗ Ｆ，ＪＩＡＮＧ Ｌ Ｈ，ＹＡＮ Ｗ Ｚ，ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ｇｅｎｅｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２００３，３０（４）：３６４－３６９．