摘要：對(duì)從漁場(chǎng)采集患細(xì)菌性敗血癥的瀕死鯉魚進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及毒力因子測(cè)試，應(yīng)用鍍銀染色、負(fù)染色技術(shù)檢測(cè)菌體。根據(jù)細(xì)菌的致病力，形態(tài)特征及鞭毛生長(zhǎng)位置、數(shù)目、長(zhǎng)短等指標(biāo)，判斷其菌體。結(jié)果表明，分離的菌體無(wú)雜菌生長(zhǎng)，嗜水氣單胞菌是鯉魚敗血癥的致病菌。

關(guān)鍵詞：鯉魚；嗜水氣單胞菌；毒力因子；菌體；檢測(cè)與分析

中圖分類號(hào)：Ｓ９１７．１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）03－0564-02

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Aｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃａｒｐ Aｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ

ＺＨＡＮＧ Ｗｅｎ－ｌｉa，ＺＨAＮＧ Ｙｕ－ｆｅｎb，ＺＨＡＮＧ Ｘｉｕ－ｊｕｎb

（ａ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ； ｂ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｔａｎｇｓｈａｎ ０６３０００， Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｉｓｈ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｉｓｈｉｎｇ ｇｒｏｕｎｄ ｄｙｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ were proceeded ｂａｃｔｅｒｉａ culturing， ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ testing， ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ， ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ bacterium． Ｔｈｅ strain ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ， ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｆｌａｇｅｌｌａｒ’s ｇｒｏｗｔｈ ｐｏｓｉｔｉｏｎ， ｎｕｍｂｅｒ， ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ，ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ bacterium ｇｒｏｗed ｗｉｔｈｏｕｔ ｏｔｈｅｒ bacterium， ａｎｄ Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ was ｔｈｅ pathogen ｏｆ ａ ｃａｒｐ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： carp； Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ； ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ； ｔｈａｌｌｕｓ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ and analysis

近年來(lái)，隨著高密度養(yǎng)殖和環(huán)境污染等原因，各種魚類疾病發(fā)病率大大增加，其中細(xì)菌性敗血癥是鯉魚的嚴(yán)重病害之一。感染細(xì)菌性敗血癥的病魚或死魚主要癥狀為兩眼突出，腹部膨大，體表有大小不等的紅斑，肛門紅腫，尾鰭潰爛。少數(shù)病變嚴(yán)重的鯉魚用手觸摸體表，鱗片即脫落。剖檢病魚可發(fā)現(xiàn)魚鰓為暗紅色，肝臟腫大，大部分呈土黃色，膽囊高度充盈，脾臟呈暗黑色，腹腔有淡紅色腹水，黏膜變黑。試驗(yàn)擬找出鯉魚細(xì)菌性敗血癥的病原菌，通過(guò)無(wú)菌細(xì)菌培養(yǎng)及毒力因子測(cè)試，判斷菌體形態(tài)特征、菌體表面結(jié)構(gòu)與鞭毛形成情況等，為細(xì)菌的分類提供檢測(cè)技術(shù)及基礎(chǔ)資料。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１患病鯉魚患病鯉魚采集于唐山市豐南養(yǎng)殖場(chǎng)。

１．１．２培養(yǎng)基及細(xì)菌鑒定條營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂斜面培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、血瓊脂平板、脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板，參照說(shuō)明制備使用；ＡＰＩ細(xì)菌鑒定條由法國(guó)梅里埃公司提供。

１．１．３儀器日本ＯＬＹＭＰＵＳ公司ＣＨＣ－２１２型光學(xué)顯微鏡；日本日立Ｈ－７６５０型透射電子顯微鏡。

１．２方法

１．２．１細(xì)菌分離培養(yǎng)無(wú)菌采取發(fā)病或?yàn)l死鯉魚的肝、脾、腎，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，２８℃ 培養(yǎng) ２４ ｈ，挑取單個(gè)菌落獲純培養(yǎng)物后，轉(zhuǎn)接于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，然后移接于營(yíng)養(yǎng)肉湯試管，置搖床培養(yǎng)１６ ｈ，涂片，供鞭毛鍍銀染色。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上菌體，２８℃培養(yǎng)１６～１８ ｈ，制成菌懸液，濃度為１．０×１０８CFU／ｍＬ，用于磷鎢酸負(fù)染色。

１．２．２毒力因子檢測(cè)將分離的菌株接種于血瓊脂平板上，２８℃培養(yǎng)２４ ｈ，觀察溶血情況并挑取單個(gè)菌落接種于含１．５％脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，２８℃培養(yǎng)２４ ｈ，以在點(diǎn)種菌生長(zhǎng)菌落周圍出現(xiàn)清晰溶蛋白圈者為陽(yáng)性。

１．２．３細(xì)菌生化鑒定經(jīng)ＡＰＩ細(xì)菌鑒定條鑒定此菌為嗜水氣單胞菌。

１．２．４鞭毛鍍銀染色取鞭毛染色液Ａ 液（３．０ ｇ ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ，１００ｍＬ ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液）０．１ｍＬ加入有塞的試管內(nèi)，再加入Ｂ液（單寧酸１５．０ ｇ溶于１００ ｍＬ去離子水中，加３７％甲醛１．０ ｍＬ）０．１ ｍＬ充分混合［１，２］，用酒精燈火焰輕微緩緩加熱１０～２０ ｓ，稍冷卻。這樣處理過(guò)的混合液染片４０ｓ即可，去離子水緩慢沖洗干凈。Ａ、Ｂ液混合物不穩(wěn)定，加熱１０ ｍｉｎ內(nèi)使用。滴加銀染液 Ｃ液（ＡｇＮＯ３ ５．０ ｇ溶于１００ ｍＬ去離子水，取出１０ ｍＬ備用）染色，加熱至微冒蒸氣，染色１０～２０ ｓ，去離子水洗凈染液，干后鏡檢。

１．２．５懸滴法負(fù)染色采用２％磷鎢酸［３］水溶液，（ｐＨ值為７．０），選用日本進(jìn)口３００目銅網(wǎng)，制成Ｆｏｒｍａｌ（聚乙烯醇縮甲醛）支持膜，厚度１００～２００ ?魡。備好試驗(yàn)操作用無(wú)菌帶蓋玻璃平皿，用１ ｍＬ注射器抽取０．１～０．２ ｍＬ菌懸液；小心滴于帶有Ｆｏｒｍａｌ膜的銅網(wǎng)上；靜置２ ｍｉｎ，用小片濾紙吸取銅網(wǎng)邊緣余液，再靜置２ ｍｉｎ（此時(shí)未全干）。用１ ｍＬ注射器抽取０．１～０．２ ｍＬ染液，滴加染液于帶菌體的銅網(wǎng)上，靜置１～２ ｍｉｎ，小片濾紙吸去銅網(wǎng)邊緣染液。自然干燥或距離普通臺(tái)燈１５～２０ ｃｍ處干燥，５ ｍｉｎ后即可電鏡觀察。為提高觀察檢測(cè)的成功率，可以同時(shí)制備２～３個(gè)菌體銅網(wǎng)。

２結(jié)果與分析

２．１致病性檢測(cè)

經(jīng)觀察，血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，典型菌落直徑１．２～２．０ ｍｍ，菌落圓形，濕潤(rùn)光滑，無(wú)色透明，邊緣整齊，菌落周圍有透明溶血環(huán)，１．５％脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板呈明顯β-溶血，菌落周圍出現(xiàn)清晰溶蛋白環(huán)。

２．２鞭毛染色

鞭毛染色結(jié)果顯示，嗜水氣單胞菌菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，中軸端直，一端有單鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，多數(shù)菌體單個(gè)排列，少數(shù)２個(gè)排列，無(wú)莢膜，無(wú)芽孢（圖１）。

２．３透射電鏡觀察

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌體一端具有極單鞭毛，長(zhǎng)約１０～２０ ｎｍ，直徑１２～３０ ｎｍ，細(xì)長(zhǎng)呈管狀；鞭毛由基礎(chǔ)小體、鉤狀體和絲狀體３部分組成［４］?；A(chǔ)小體位于鞭毛根部，嵌在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜中；鞭毛伸出細(xì)胞壁的部分為鉤狀體，呈９０°彎曲，絲狀體伸出菌體外，由鞭毛蛋白緊密排列并纏繞而形成中空的管狀結(jié)構(gòu)。菌體周身布滿菌毛［５］，Ｒ（Rａｇｉｄ）菌毛短而硬，數(shù)量多，周身分布，Ｗ（Wａｖｙ）菌毛長(zhǎng)而易彎曲，數(shù)量少，電鏡下形態(tài)更加清晰（圖２）。鏡下無(wú)雜菌生長(zhǎng)，菌體分布均勻，菌體鞭毛清晰可辨，無(wú)聚集現(xiàn)象，染色背景干凈。

３討論

嗜水氣單胞菌是鯉魚敗血癥的條件致病菌，在適宜的條件如水質(zhì)環(huán)境差、魚體抵抗力下降、魚體狀態(tài)差或魚體表面受傷鱗片脫落，菌體就會(huì)趁機(jī)侵入魚體并大量繁殖。同時(shí)細(xì)菌產(chǎn)生大量的毒力因子，如溶血毒素、細(xì)胞毒素、腸毒素等，使魚體腸道積液分泌增多，紅細(xì)胞裂解，吞噬白細(xì)胞，損壞毛細(xì)血管，引起出血、敗血，細(xì)胞毒素侵入實(shí)質(zhì)組織器官，使組織細(xì)胞溶解，引起細(xì)胞變性，組織滲透性增加，利于細(xì)菌擴(kuò)散。試驗(yàn)中細(xì)菌分離菌株產(chǎn)生了β-溶血環(huán)，說(shuō)明此菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力，是導(dǎo)致鯉魚大量死亡的原因之一。

鞭毛的數(shù)量、形態(tài)與在菌體上的分布位置是鑒定細(xì)菌的重要指標(biāo)，由于鞭毛纖細(xì)，必須采用特殊方法染色才能在顯微鏡下觀察到。電鏡負(fù)染色檢測(cè)試驗(yàn)中未使用牛血清白蛋白等分散劑，說(shuō)明此菌懸液純度和濃度適宜，對(duì)電鏡負(fù)染色觀察效果較好。本試驗(yàn)染色未在樣品完全干燥后進(jìn)行，染色時(shí)機(jī)掌握較好，菌體懸液在銅網(wǎng)上靜置時(shí)間比在染液中稍長(zhǎng)些，避免了不帶菌現(xiàn)象。已確認(rèn)鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官［６］，細(xì)菌在鞭毛的帶動(dòng)下，朝富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)處運(yùn)動(dòng)，它還在細(xì)菌的粘附定居和侵入組織細(xì)胞中起到重要用。試驗(yàn)中營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的菌體生長(zhǎng)良好，鏡下未發(fā)現(xiàn)雜菌生長(zhǎng)，鞭毛染色及電鏡檢測(cè)中未發(fā)現(xiàn)脫落鞭毛。

嗜水氣單胞菌是弧菌科氣單胞菌屬，致病因子有外毒素、內(nèi)毒素、胞外酶等，外膜蛋白是革蘭氏陰性菌。菌體菌毛是一種重要的粘附因子，菌毛協(xié)助細(xì)菌粘附于宿主細(xì)胞上，細(xì)菌在鯉魚體內(nèi)增殖發(fā)揮毒素的毒性。Ｗ菌毛與細(xì)菌的粘附及血凝作用有關(guān)，是一種粘附素，Ｒ菌毛與細(xì)菌的自凝作用有關(guān)［５］，不是粘附素，但菌毛也是影響菌株的毒力因子之一，在細(xì)菌的致病機(jī)制中起著重要作用。嗜水氣單胞菌感染范圍非常廣泛，國(guó)內(nèi)已有相關(guān)報(bào)道，可引起甲魚［７］、蟹［８］、雞［９］等患病，也可引起人類腹瀉及食物中毒等［１０，１１］，是魚類疾病的主要病原菌，發(fā)病率和死亡率都很高，往往給淡水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)嗜水氣單胞菌的及時(shí)檢測(cè)、分類和防治顯得越來(lái)越重要。

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