閆韶飛 文朝陽 高爾靜 牛 靜 鄭少鵬 丁 衛(wèi)*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)分析測試中心，北京 100069)

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是基因治療中發(fā)展比較成熟的病毒載體之一，其中Ⅱ型腺相關(guān)病毒(AAV2)的應(yīng)用最為廣泛［1］。近年來的研究［2-4］結(jié)果提示，腺相關(guān)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程是其轉(zhuǎn)導(dǎo)激活并表達(dá)所攜帶外源基因時(shí)所需要的主要限速步驟之一。然而病毒在被細(xì)胞內(nèi)吞后的分選(sorting)步驟通常是非常復(fù)雜的多階段動(dòng)態(tài)過程，并且常常具有很強(qiáng)的多態(tài)性。盡管在過去基于對細(xì)小病毒種屬的研究中，曾有其在晚期內(nèi)體分選的電鏡證據(jù)等提示性結(jié)果，但對于腺相關(guān)病毒這一家族成員在特定細(xì)胞系中內(nèi)體分選的情況，特別是應(yīng)用現(xiàn)代熒光標(biāo)記和成像技術(shù)的直接研究相對較少，且部分報(bào)道［3，5-7］存在分歧。

當(dāng)前在針對細(xì)胞囊泡運(yùn)輸及其分選機(jī)制的主流研究中，RAB蛋白是公認(rèn)的特異性最好的囊泡類型標(biāo)志物。其中RAB7在成熟的晚期內(nèi)體(late endosome，LE)表面有比較廣泛的特異性分布，不僅參與了晚期內(nèi)體的正常生物學(xué)功能，同時(shí)也可以用作晚期內(nèi)體的示蹤和分離標(biāo)志物［8］。RAB11是細(xì)胞內(nèi)循環(huán)內(nèi)體 (recycling endosome，RE)的標(biāo)志物，與RAB7陽性的晚期內(nèi)體有著截然不同的形態(tài)和分布，2者較少存在交叉［9］。IB3細(xì)胞是取源于男性囊性肺纖維化患者的支氣管上皮組織，經(jīng)SV40腺病毒感染永生化后所得到的細(xì)胞系。IB3細(xì)胞對AAV2有較好的易感性，比較容易進(jìn)行質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)［10］。正常培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長比較鋪展，比較適于進(jìn)行高分辨力的顯微圖像分析。此外，IB3細(xì)胞的內(nèi)體豐富，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑活躍，在病毒分離實(shí)驗(yàn)的回收效率較好。因此，本研究中采用了該細(xì)胞系為研究對象，利用形態(tài)學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的不同方法針對AAV的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

IB3細(xì)胞從美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)獲得，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的 DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。腺相關(guān)病毒AV2.luc由本實(shí)驗(yàn)室依照經(jīng)典的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)染293T宿主細(xì)胞制備，經(jīng)氯化銫梯度離心進(jìn)行純化，透析后由qPCR方法確定病毒滴度后分裝備用。PCR引物和探針購自美國IDT公司。Rab7和Rab11的GFP和HA標(biāo)簽質(zhì)粒由美國愛荷華大學(xué)Dr.Engelhardt實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。HA單克隆抗體購自羅氏公司。FITC-Dextran購于Invitrogen公司。60%碘克沙醇儲(chǔ)存原液和Dynabeads分別為Invitrogen和挪威Nycomed公司產(chǎn)品。RAB7的小干擾RNA(sc29460)由美國Santa Cruz公司提供。其他化學(xué)試劑如未經(jīng)特殊說明均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 腺相關(guān)病毒的熒光標(biāo)記與共聚焦顯微成像

將總量為1×1 011顆粒的純化腺相關(guān)病毒AV2.luc解凍后重懸于0.5 mL PBS，并與新鮮配制的等體積含有適量AF568熒光染料的100 mmol/L NaHCO3(pH 9.3)混合，室溫孵育30 min，其間每10 min充分混勻1次，以10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)終止反應(yīng)。標(biāo)記后的病毒通過分子篩柱層析去除過量染料，用超濾離心管濃縮后，通過qPCR進(jìn)行滴度測定，分裝備用。

IB3細(xì)胞被接種到0.13 mm蓋玻片上，待生長至50%匯合，用Lipofectamine 2000將GFP-Rab7或GFPRab11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至IB3細(xì)胞，24 h后將細(xì)胞進(jìn)行10 min 4℃預(yù)冷，與約10 000病毒顆粒/細(xì)胞的AF568-AV2.luc在4℃下孵育20 min，隨后移至37℃ 培養(yǎng)2 h。感染后，細(xì)胞用冰預(yù)冷的PBS漂洗4次，經(jīng)4%多聚甲醛固定，以DAPI復(fù)染細(xì)胞核，使用Leica共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察和成像。

1.3 密度梯度離心和免疫親和沉淀法分離含有感染后病毒顆粒的細(xì)胞內(nèi)體

將IB3細(xì)胞接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞70%匯合。用經(jīng)典的磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入HA-RAB7或用于其他對照組實(shí)驗(yàn)的過表達(dá)質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后。在4℃下將感染復(fù)數(shù)m.o.i(multiplicity of infection)為10 000 病毒/細(xì)胞的AV2.luc病毒與細(xì)胞孵育30 min后，轉(zhuǎn)入37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h。感染后的細(xì)胞短暫胰酶消化收集后，用冰預(yù)冷的勻漿緩沖液(250 mmol/L蔗糖，10 mmol/L三乙醇胺，EDTA和PMSF各1 mmol/L)重懸，在冰上研磨。通過相差顯微鏡觀察去核的細(xì)胞比例達(dá)60%～80%時(shí)，800 g低速條件下離心10 min，得到PNS(perinuclear supernatant)上清。將1.5 mL的PNS混合碘克沙醇調(diào)整到32%的終濃度并加載到SW55Ti離心管底部，依次覆蓋24%的碘克沙醇1.5 mL和20%碘克沙醇1.5 mL，最后充滿勻漿緩沖液。經(jīng)過4℃，124 000 g離心1 h，從離心管頂部依次收集11個(gè)組分，每份收集物約為0.5 mL。將第2～4組分合并，與預(yù)先包被 HA抗體和經(jīng)過1%BSA封閉的Dynabeads磁珠混合，室溫震蕩孵育4～6 h，以磁鐵吸附固定磁珠，收集上清并標(biāo)記為unbound;磁珠經(jīng)PBS漂洗2次后，用1.5 mol/L NaCl洗脫，標(biāo)記為 bound，其中的回收病毒經(jīng)Taqman定量PCR測定滴度后，作相應(yīng)的稀釋，可用于二次感染實(shí)驗(yàn)。

1.4 Taqman定量PCR方法進(jìn)行腺相關(guān)病毒的滴度測定

含有AV2.luc的細(xì)胞內(nèi)體用不含核酸酶的蛋白激酶K經(jīng)55℃消化過夜，然后煮沸10 min終止反應(yīng)。TaqMan qPCR的引物和探針由Primer Express V1.5軟件設(shè)計(jì)，針對熒光素酶編碼區(qū)引物和探針序列分別為 P1:5'-TTTTTG AAGCGA AGGTTG TGG-3'，P2:5'-CACACA CAGTTC GCCTCT TTG-3';probe:5'-ATCTGG ATACCG GGAAAA CGCTGG GCGTTA AT-3'，其中5'和3'末端分別帶有6羧基熒光素(FAM)和6羧基四甲基熒光紅(TAMRA)標(biāo)記。體積為25 μL的PCR反應(yīng)體系組成為:待測樣本或AV2.luc標(biāo)準(zhǔn)稀釋樣品 10 μL;引物和探針共 2.5 μL，終濃度分別為500和100 nmol/L;通用型PCR Master Mix(ABI公司)12.5 μL。定量檢測由 ABI-7700設(shè)備完成，PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min后開始雙步法擴(kuò)增(95℃ 15 s、60℃ 60 s)，共40個(gè)循環(huán)。

1.5 熒光素酶活性測定

IB3細(xì)胞以40%～50%的匯合密度接種于48孔板中，在含10%FBS的DMEM中培養(yǎng)24 h后，回收的AV2.luc以500病毒顆粒/細(xì)胞的劑量感染48 h后，用裂解液溶解，根據(jù)Promega公司試劑盒推薦實(shí)驗(yàn)條件，使用Lumat 9500B儀器進(jìn)行熒光酶的活性測定。

接種于24孔培養(yǎng)板的IB3細(xì)胞分別進(jìn)行不同的質(zhì)?；蛐NA轉(zhuǎn)染24 h后，或經(jīng)過10 μmol/L BFA處理12 h后，以1 000病毒顆粒/細(xì)胞的AV2.luc感染細(xì)胞48 h后，依照同樣的方法，測定熒光素酶的活性。

2 結(jié)果

本研究首先利用熒光標(biāo)記技術(shù)通過形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了RAB7與AAV2在IB3細(xì)胞中顯著的共定位現(xiàn)象，繼而建立了用于回收感染后經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入RAB7囊泡中AAV2的分離和純化方法。通過將回收的病毒用于對細(xì)胞的二次感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)導(dǎo)IB3細(xì)胞的活性發(fā)生了改變。最后，通過RNA干擾和化學(xué)藥物處理的手段改變RAB7介導(dǎo)的內(nèi)體分選途徑，驗(yàn)證了RAB7所參與的晚期內(nèi)體成熟過程在腺相關(guān)病毒的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)導(dǎo)激活步驟中發(fā)揮了重要的作用。上述結(jié)果，分別由如下圖1至圖4順序顯示。

圖1 AlexaFluor568標(biāo)記的Ⅱ型腺相關(guān)病毒與細(xì)胞內(nèi)GFP-RAB蛋白在IB3細(xì)胞內(nèi)的共定位分析Fig.1 The intracellular localization of AlexFluor568-labeled adeno-associated virus in IB3 cells transfected with GFP-RAB fusion proteins

3 討論

病毒的熒光標(biāo)記技術(shù)為以細(xì)胞影像學(xué)手段研究感染動(dòng)力學(xué)提供了極大的方便，并且在腺相關(guān)病毒的研究中有過一些嘗試［11-12］。隨著激光共聚焦技術(shù)的發(fā)展，為進(jìn)一步認(rèn)識AAV在細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布和定位提供了可能。

圖4 對晚期內(nèi)體成熟過程的干擾降低Ⅱ型腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)在IB3細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性Fig.4 The interference of the maturation of the late endosome impaired the transduction activation of adeno-associated virus in IB3 cells

RAB家族成員是一類與Ras具有較高同源性的小相對分子質(zhì)量GTP酶，其種類繁多且在進(jìn)化中有較高的保守性，目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)多達(dá)70余種。RAB在細(xì)胞的內(nèi)吞、分泌、囊泡的成熟、融合和運(yùn)輸?shù)纫幌盗屑?xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著極為重要的作用，不同類型的囊泡表面通常會(huì)攜帶不同種類的RAB蛋白及其效應(yīng)分子，其相對的特異性分布被形象地稱為是細(xì)胞內(nèi)膜和囊泡系統(tǒng)的“郵政編碼(zip code)”［13-14］。各種 RAB在 N端的 GFP融合蛋白均基本保留了野生型RAB蛋白的正常活性，因而成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要工具。針對RAB蛋白在結(jié)合GTP的模序部分而設(shè)計(jì)的突變體，使其失去水解GTP成為GDP的酶學(xué)活性，可以產(chǎn)生相應(yīng)RAB的顯性抑制變異體形式(dominant-negative variant)，其在細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá)可以用來對相應(yīng)野生型RAB的正常功能進(jìn)行逆向分析和驗(yàn)證。此外，針對不同RAB的RNA干擾技術(shù)和一些影響細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的藥物處理也是研究RAB功能的有效手段［3］。如:布雷菲德菌素(Brefeldin A，BFA)是一種真菌代謝產(chǎn)物，常被用作細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制劑。BFA能夠可逆性地阻斷蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的運(yùn)送，可以通過抑制一些GTP水解酶的GTP交換因子，從而影響細(xì)胞內(nèi)膜形成轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡(transport vesicles)。許多實(shí)驗(yàn)［6］證據(jù)表明，經(jīng)過BFA處理后的細(xì)胞其內(nèi)體的成熟過程受到嚴(yán)重的干擾和影響較高相對分子質(zhì)量的葡聚糖Dextran在晚期內(nèi)體中可以有較強(qiáng)的富集現(xiàn)象，而FITC等熒光標(biāo)記的Dextran可以作為“負(fù)荷物(cargo)”用于晚期內(nèi)體的加載(loading)或示蹤(tracing)實(shí)驗(yàn)。本研究首先通過共聚焦顯微成像分析確認(rèn)了AAV2在RAB7陽性的囊泡中有比較廣泛的分布，這與以其他細(xì)胞模型的部分早期報(bào)道［5-6］一致。并且本研究的結(jié)果提示，在IB3細(xì)胞中RAB7與標(biāo)記病毒的共定位程度大大高于RAB11的情況，RAB7的過表達(dá)或顯性抑制均可能對AAV在感染后細(xì)胞內(nèi)的分布產(chǎn)生較大的影響。

包括腺相關(guān)病毒在內(nèi)的細(xì)小病毒家族成員在轉(zhuǎn)導(dǎo)活化的過程中很大程度上依賴于宿主細(xì)胞的受體依賴性內(nèi)吞途徑，盡管一系列的研究證據(jù)，如溫度、ATP、Dynamin和細(xì)胞骨架系統(tǒng)對病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響等［15-16］，以及包括免疫電鏡圖像數(shù)據(jù)，均比較支持類似的推論，但是利用生化分離技術(shù)回收感染后的病毒顆粒并且重新評價(jià)其感染活力的嘗試由于具有相當(dāng)?shù)奶魬?zhàn)性而比較缺乏［17］。本研究首先利用了具有高度特異性和親和力的HA生化標(biāo)簽，通過轉(zhuǎn)染HA-RAB過表達(dá)功能性融合蛋白，優(yōu)化了針對晚期內(nèi)體的病毒回收和分離技術(shù)，獲得了比較穩(wěn)定可靠的結(jié)果。隨后將回收的病毒用于2次感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在RAB7陽性晚期內(nèi)體中的AAV具有較高的感染活力。在進(jìn)一步的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，干擾RAB7參與的晚期內(nèi)體成熟過程，可以導(dǎo)致AAV2對IB3細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的降低。

雖然AAV能夠以完整的病毒顆粒形式進(jìn)入宿主細(xì)胞核中，但也有研究［2-3，18］表明病毒在胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)改變、衣殼蛋白化學(xué)修飾、從內(nèi)體中的逃逸，甚至徹底的脫衣殼過程，同樣對病毒的激活至關(guān)重要。也有報(bào)道［19-20］認(rèn)為，晚期內(nèi)體的弱酸性環(huán)境，有利于暴露AAV衣殼蛋白中的保守性磷脂酶A活性片段，從而幫助病毒脫離內(nèi)體的包被，加速細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)和脫衣殼過程。本研究的結(jié)果大體與類似的假說推論相符合，但是回收病毒在2次感染中的活性增加程度相對有限，表明晚期內(nèi)體所造成的病毒性質(zhì)改變未必非常顯著，并且有可能存在較大的異質(zhì)性。此外，從本研究的結(jié)果中并不能推測回收病毒所具有的不同轉(zhuǎn)導(dǎo)活性究竟是由于衣殼蛋白的器質(zhì)性改變，還是由于回收病毒中復(fù)合了細(xì)胞膜、受體分子或其他有助于病毒感染的成分。盡管如此，本研究對于分別從RAB7和RAB11囊泡分離的AAV在感染活性上存在差異的結(jié)果，為此前類似的發(fā)現(xiàn)和報(bào)道提供了更為直接的證據(jù)［5-7］。只是2者在程度上的差別可能與感染的滴度或細(xì)胞類型的不同有關(guān)［5］。

關(guān)注AAV在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程及其調(diào)節(jié)因素不僅可以加深和豐富對基因工程病毒載體的認(rèn)識，推動(dòng)其感染動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)研究，為載體的進(jìn)一步改良提供線索［21］，并且很可能在AAV的臨床應(yīng)用中有著更加現(xiàn)實(shí)的意義，成為優(yōu)化病毒使用適應(yīng)證和方案的考慮因素之一。

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