姜 新 相榮才 白麗娟 張賀敏 陳曉虹 馬恩龍

(1.遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110016;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)部生物物理教研室，沈陽 110012;3.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，沈陽 110016)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)，是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，病理特征為細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纏結(jié)及細(xì)胞外老年斑。老年斑是局灶性炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)局灶被小膠質(zhì)細(xì)胞包圍及浸潤(rùn)。AD病人中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是前炎介質(zhì)及神經(jīng)毒性物質(zhì)的主要產(chǎn)生者［1］。β 淀粉樣蛋白(amyloid protein β)級(jí)聯(lián)學(xué)說是目前學(xué)者比較認(rèn)同的學(xué)說之一。據(jù)報(bào)道［1］，Aβ1-42可通過幾個(gè)細(xì)胞表面受體與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用，因此可能參與AD腦中小膠質(zhì)細(xì)胞損傷環(huán)路［2-3］。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)重要的免疫細(xì)胞之一，在許多疾病，如腦缺血、炎性反應(yīng)、外傷、脫髓鞘中起重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞在AD中的作用是保護(hù)還是加重?fù)p傷尚有爭(zhēng)論。本研究用一種前炎介質(zhì)肽聚糖(peptidoglycan，PGN)作用于Aβ寡聚體處理的BV2細(xì)胞(代替小膠質(zhì)細(xì)胞)，探討PGN對(duì)BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ寡聚體的影響及其機(jī)制的探討。

1 材料和方法

1.1 材料

1)BV2細(xì)胞株:購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物研究所，細(xì)胞株來源于德國(guó)DSMZ(German collection of microorganisms and cell cultures)，采集于小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞瘤。

2)主要試劑:胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、無酚紅F12培養(yǎng)液(Gibco公司);Aβ1-42、六氟丙醇(Hexafluoro isopropyl，HFIP)，(Sigma公司)、PGN(美國(guó) Sigma 公司);SB202190(Alexis公司);W peptide(Innovagen公司);抗-Aβ1-42抗體、FITC-抗兔抗體(武漢博士德公司);BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Pierca公司);抗p-p38 MAPK抗體抗、p38 MAPK抗體(北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司);mFPR2 mRNA及鼠-actin mRNA RT-PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 方法

1)BV2細(xì)胞培養(yǎng):BV2細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，37℃ 5%CO2及飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待單層培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合后傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前1 d將BV2細(xì)胞以1×104/孔種植于24孔培養(yǎng)板中。

2)Aβ1-42寡聚體的制備:按 Klein WL(2002)方法［4］制備 Aβ1-42寡聚體，22.2 μL 冷卻的 HFIP+1 mg Aβ1-42室溫孵育60 min，將肽-HFIP溶液放置冰上10 min后，使HFIP在室溫下?lián)]發(fā)、過夜。真空冷凍干燥機(jī)60 min，除去所有HFIP，分裝后于－80℃保存。冰上制作5 mmol/L Aβ/100%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO):4.44 μL 新鮮脫水 DMSO+0.1 mg 多肽。加439.56 μL無酚紅F12培養(yǎng)液稀釋至終濃度為50 μmol/L，4 ℃孵育24 h。4 ℃ 14 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新管，即為寡聚體。

3)分組:① 檢測(cè)BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ:A組為BV2組，未加任何物質(zhì);B組為PGN+BV2組，加入PGN(20 mg/L);C 組為 Aβ +BV2，加入 Aβ(0.5 μmol/L);D 組為PGN+Aβ+BV2，加入PGN(20 mg/L)孵育24 h再加入 Aβ(0.5 μmol/L);E 組為 Aβ +BV2+W peptide，加入 W peptide(1 μmol/L)孵育 1 h，再加入 Aβ(0.5 μmol/L);F 組為 PGN+Aβ +BV2+W peptide，加入PGN(20 μg/mL)，孵育 24 h 后，再加 W peptide(1 μmol/L)孵育1 h 后，加入 Aβ(0.5 μmol/L)，上述各組均孵育24 h，觀察BV2細(xì)胞。② 檢測(cè)BV2細(xì)胞pp38MAPK、p38MAPK:PGN 20 mg/L分別加入BV2細(xì)胞培養(yǎng)基中，分別孵育 5、15、30、60、120 min。③ 檢測(cè)BV2 細(xì)胞 mFPR2 mRNA:PGN(0、1、3、5、10、20 mg/L)分別加入BV2細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵育24 h。PGN(20 mg/L)加入 BV2 細(xì)胞培養(yǎng)基中，分別孵育 0、3、6、12、18、24 h。SB202190(0、1、10、20、30 μmol/L)分別加入 BV2 細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵育1 h，再分別加入PGN20 mg/L孵育24 h，對(duì)照組未加任何試劑。

4)免疫熒光染色鑒定BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ的量:細(xì)胞棄去上清后，以4%多聚甲醛室溫孵育20 min;以0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min;以含5%羊血清，0.05%Tween 20的0.1 mol/L PBS室溫孵育1 h;加入兔抗鼠Aβ1-42(1∶200稀釋于5%羊血清中)室溫孵育1 h;以0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min;FITC-抗兔 IgG抗體(1∶500稀釋于1%牛血清的Tris-buffered液中)室溫孵育1 h;以0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min;碘化丙啶染色室溫20 min;75%中性緩沖甘油封片，熒光顯微鏡鏡下觀察，F(xiàn)ITC 488 nm，碘化丙啶561 nm。BV2細(xì)胞顯紅色，Aβ1-42顯綠色。Aβ1-42計(jì)數(shù):免疫熒光顯微鏡鏡下觀察，24孔培養(yǎng)板上每孔隨機(jī)選取10個(gè)視野，進(jìn)行Aβ1-42及BV2細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔Aβ1-42占BV2細(xì)胞的百分比數(shù)，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

5)Western blotting方法檢測(cè)各組BV2細(xì)胞pp38MAPK、p38MAPK蛋白表達(dá)情況:①樣品的制備:將蛋白裂解緩沖液(預(yù)冷至0℃)加入A組各時(shí)間段BV2細(xì)胞中，靜置20 min;用細(xì)胞刮棒收集細(xì)胞，連同裂解緩沖液一起轉(zhuǎn)移至經(jīng)過冷卻的微量離心管中;于4℃以12 000 r/min離心2 min;將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)微量離心管中，保存于－80℃待用。② 蛋白定量分析(bicinchonic acid asay，BCA法):按照試劑盒說明書進(jìn)行，A、B、C 試劑按照 50∶50∶2 比例混合后配制為工作液。梯度稀釋BCA標(biāo)準(zhǔn)品，分別吸取待測(cè)樣品及梯度蛋白到微孔板對(duì)應(yīng)孔中，稀釋混勻后在37℃孵育30 min。以96孔酶標(biāo)儀于570 nm處檢測(cè)OD值，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后得出各樣本蛋白濃度。③蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析:制備凝膠按比例配制分離膠及濃縮膠，插入梳子;將玻璃板電泳槽中，加入1×甘氨酸-Tris電泳緩沖液;用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調(diào)為一致:2 g/L;用微量進(jìn)樣器逐個(gè)點(diǎn)樣，每孔加樣25 μL樣本，同時(shí)點(diǎn)預(yù)染蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(marker);電泳，濃縮膠80 V，分離膠120 V。電泳直至溴酚蘭達(dá)到分離膠底部，終止電泳。將膠取出，切去膠左上角，作為標(biāo)記;轉(zhuǎn)膜:膠與在預(yù)冷的轉(zhuǎn)印緩沖液中與預(yù)濕過的膜、濾紙，按陰極-濾紙-凝膠-膜-濾紙-陽極順序組裝，使用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)于4℃ 50 V、30 mA轉(zhuǎn)移2 h;檢測(cè):取出膜，封閉1～2 h，封閉液為5%脫脂奶粉。用洗膜溶液略洗一下，在室溫下將p-p38MAPK、p38MAPK一抗分別以1∶1 000稀釋于封閉緩沖液中，4℃過夜。漂洗后，室溫下將二抗按1∶4 000比例稀釋，孵育60 min;化學(xué)發(fā)光顯色，計(jì)算機(jī)掃描分析。

6)PCR方法檢測(cè)各組BV2細(xì)胞mFpr2 mRNA:(1)RNA的提取:吸凈培養(yǎng)液，將1 mL Trizol加入培養(yǎng)板，緩慢搖動(dòng)，室溫放置5 min，反復(fù)吹吸幾次收集。轉(zhuǎn)移至 1.5 mL Eppendoff管中，1 mL/次。去蛋白、去DNA:加入0.2 mL三氯甲烷，用力振搖45 s;室溫放置2～3 min;4℃，15 000 r/min離心3 min;轉(zhuǎn)移上層水相(約0.6 mL)至1.5 mL 管中。RNA 沉淀:加入 0.6 mL異丙醇，混勻;室溫放置10 min;4℃，15 000 r/min離心5 min;棄上清，沉淀以1 mL 75%乙醇洗滌;4℃，15 000 r/min離心1 min;沉淀于室溫晾干(約5～10 min)。溶解 RNA:以20 μL 0.1%的 DEPC 水溶解;取1～3 μL 稀釋 200 μL，測(cè)定 OD260及 OD280;計(jì)算 RNA量。(2)RT-PCR:① PCR引物序列:BDNF(268 bp)上游:5'-TCTACCATCTCCAGAGTTCTGTTGG-3'，下游:5'-TACATCTACCACAATGTGAACTA-3';β-actin(514 bp)上游:5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCA-3'，下游:5'-TTTGATGTGACGCACGATTTCCC-3'。②反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA:反應(yīng)體系如下:MgCl2(2 μL)、10 × RT buffer(1 μL)、RNase free dH2O(3.75 μL)、dNTP Mixture(各 10 mmol/L)(1 μL)、RNase inhibitor(0.25 μL)、AMV reverse transcriptase(0.5 μL)、Random 9 mers(0.5 μL)、Positive Control RNA(1 μg)，混勻快速離心1次，反應(yīng)條件如下:30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃5 min，5℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后于－20℃ 冰箱凍存30 min。③ PCR 反應(yīng):模板 cDNA(2.5 μL)、5 × PCR Buffer(2.5 μL)、滅菌蒸餾水(7.2 μL)、聚合酶 Ex Taq HS(0.1 μL)、上游引物 (0.1 μL)、下游引物(0.1 μL)Total(12.5 μL)混勻快速離心 1 次，反應(yīng)條件:94 ℃，2 min。1 循環(huán);94 ℃，40 s，62、60、60、57℃，40 s、72 ℃，1 min，30 循環(huán);72 ℃，5 min 1 循環(huán)。(3)RT-PCR產(chǎn)物電泳及定量分析:制備瓊脂糖凝膠:1.5%瓊脂糖，用1×TAE緩沖液溶解，置微波爐加熱至完全熔化，取出搖勻，稍冷卻后加0.5 mg/L EB(溴化乙錠)染色液，搖勻。灌膠:將冷卻至60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩慢倒入電泳內(nèi)槽，直至所需厚度。加入1×TAE緩沖液至電泳槽，緩沖液剛沒過凝膠表面即可。加樣:取PCR產(chǎn)物8 μL，加5×Loading buffer 2 μL，加入凝膠的點(diǎn)樣孔。(4)電泳:以100 V電壓電泳1 h。泳畢，溴化乙錠染色，在紫外投射燈下觀察結(jié)果，凝膠成像儀成像并進(jìn)行圖像分析。記錄每條擴(kuò)增帶的灰度值，將每一個(gè)目的擴(kuò)增片斷的吸光度值與相應(yīng)的內(nèi)對(duì)照β-actin擴(kuò)增片斷吸光度值的比值作為所測(cè)指標(biāo)的半定量指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。應(yīng)用單因素方差分析及檢驗(yàn)判斷結(jié)果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PGN對(duì)BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ的影響

BV2細(xì)胞熒光染色:BV2細(xì)胞呈紅色，Aβ1-42寡聚體呈綠色(圖1)，圖2顯示PGN激活BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ1-42寡聚體增多，且BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ1-42寡聚體與mFPR2表達(dá)有關(guān)。PGN+Aβ+BV2與 Aβ+BV2相比，BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ量明顯增多(P＜0.01);W-peptide+PGN+Aβ+BV2與PGN+Aβ+BV2相比，BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ量明顯減少(P＜0.01)，而W-peptide+PGN+Aβ+BV2與Aβ+BV2+W-peptide相比(P＞0.05)，提示 PGN激活 BV2細(xì)胞內(nèi)吞 Aβ增多，W-peptide(mFPR2拮抗劑)抑制BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ，可能與mFPR2表達(dá)增多有關(guān)。

圖1 熒光顯微鏡:BV2細(xì)胞熒光染色呈紅色，Aβ1-42寡聚體呈綠色Fig.1 Under the fluorescence microscope，BV2 cells presented red color，and Aβ oligomers presented green color(200×)

圖2 PGN對(duì)BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ的影響Fig.2 The influence of PGN on BV2 cells after endocytosis of Aβ

2.2 PGN引起 BV2細(xì)胞的 mFPR2 mRNA表達(dá)情況

經(jīng)PGN處理后BV2細(xì)胞表達(dá)mFPR2 mRNA增多(圖3)。并且隨著PGN濃度增加，mFPR2 mRNA表達(dá)也增加。計(jì)算 mFPR2 mRNA/β-actin mRNA比值，以確定不同濃度PGN處理BV2細(xì)胞的mFPR2 mRNA程度，結(jié)果如圖4表明，PGN可引起B(yǎng)V2細(xì)胞表達(dá)mFPR2 mRNA增多，濃度超過10 mg/L時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)PGN 20 mg/L處理后BV2細(xì)胞表達(dá)mFPR2 mRNA增多，并且隨著PGN時(shí)間增加，mFPR2 mRNA表達(dá)也增加(圖7)。計(jì)算mFPR2 mRNA/β-actin mRNA比值，以確定不同時(shí)間PGN處理BV2細(xì)胞的mFPR2 mRNA程度，結(jié)果如圖6表明，PGN可引起B(yǎng)V2細(xì)胞表達(dá)mFPR2 mRNA增多，存在時(shí)間依賴關(guān)系，12 h時(shí)mFPR2 mRNA表達(dá)最多，在6 h(P ＜0.05)、12、18、24 h 分別比對(duì)照組明顯增多(P ＜0.01)。

2.3 SB202190對(duì) PGN引起 BV2細(xì)胞的 mFPR2 mRNA表達(dá)影響情況

PGN可引起B(yǎng)V2細(xì)胞表達(dá)mFPR2 mRNA增多，可被 SB202190-p38MAPK抑制劑抑制，且隨著SB202190濃度增加，抑制程度增加(圖7)。計(jì)算mFPR2 mRNA/β-actin mRNA比值，以確定 mFPR2 mRNA表達(dá)程度，結(jié)果如圖8表明，各組濃度與0 μmol/L相比，明顯抑制，1 μmol/L 組 P ＜ 0.05，10、20、30 μmol/L組均 P ＜0.01。

2.4 PGN對(duì) BV2細(xì)胞 p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)PGN20 mg/L作用 BV2細(xì)胞后，以 Western blotting檢測(cè)磷酸化 p38MAPK(p-p38MAPK)、總p38MAPK，可見在15 min時(shí)磷酸化p38MAPK表達(dá)量最高，依次在 30 min，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，磷酸化p38MAPK表達(dá)量逐漸下降，而總p38MAPK表達(dá)量未見明顯差異(圖9)。計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)磷酸化p38MAPK與總p38MAPK比值以確定p38MAPK激活程度，結(jié)果如圖10表明，PGN作用 BV2細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)p38MAPK的磷酸化激活程度同對(duì)照組相比有明顯差異(P＜0.01)，提示PGN激活BV2細(xì)胞有 MAPK信號(hào)通路參與。

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是神經(jīng)變性疾病，病理方面存在3大特征:大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)的 β 淀粉樣蛋白(amyloid β-peptid，Aβ)在胞外沉積并形成老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle，NFT)、神經(jīng)元突觸功能異常及膽堿能神經(jīng)細(xì)胞丟失［5-7］。

根據(jù)β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說［8］，Aβ產(chǎn)生和清除之間的平衡逐漸改變，聚集態(tài)的Aβ累積引發(fā)連串的復(fù)雜反應(yīng)，Aβ產(chǎn)生增多是AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。β淀粉樣蛋白(Aβ)基本結(jié)構(gòu)中都含40或42個(gè)氨基酸多肽。Aβ毒性，以前認(rèn)為只有可溶性Aβ聚集成不可溶性Aβ纖絲時(shí)才具有強(qiáng)毒性［9］。近期大量研究［10-11］表明不僅聚集態(tài)的Aβ具有神經(jīng)毒性，且是導(dǎo)致其他病理變化出現(xiàn)的主要原因。所以近年國(guó)外學(xué)者［12］經(jīng)常采用一種由Aβ聚集成的無纖維結(jié)構(gòu)的，其內(nèi)包含大量的球形聚集體的彌散性Aβ聚集體ADDLs，來研究Aβ的神經(jīng)毒性，因制備比較麻煩，國(guó)內(nèi)應(yīng)用尚少。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)內(nèi)主要的免疫細(xì)胞之一，在一定的病理?xiàng)l件下可被激活，一方面通過吞噬腦組織中的病原體、有害顆粒及死亡神經(jīng)細(xì)胞殘骸和變性的突觸，以及分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用［13-16］:而另一方面通過釋放和/或分泌一系列潛在的神經(jīng)毒性物質(zhì)和炎性介質(zhì)，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用［17-23］。小膠質(zhì)細(xì)胞幾乎參與所有CNS疾病的發(fā)生和發(fā)展過程如腦缺血、炎性反應(yīng)、變性病等。在AD中，小膠質(zhì)細(xì)胞的作用也一樣很有爭(zhēng)議。

Aβ1-42可通過幾個(gè)細(xì)胞表面受體與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用［1］，這些受體中G蛋白偶聯(lián)人的FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)和他的鼠同系物mFPR2能介導(dǎo)Aβ1-42對(duì)髓細(xì)胞系(包括小膠質(zhì)細(xì)胞)的化學(xué)活性，因此可能參與AD腦中小膠質(zhì)細(xì)胞損傷環(huán)路［2-3］。在人巨噬細(xì)胞，F(xiàn)PRL1對(duì)Aβ1-42內(nèi)吞攝取至關(guān)重要，也是Aβ1-42聚集及降解的重要過程［1-3，24-27］。總之，F(xiàn)PRL1在AD的炎性反應(yīng)性斑塊及神經(jīng)變性中起重要作用。

在大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞FPRL1鼠同系物mFPR2的表達(dá)由前炎刺激物調(diào)節(jié)產(chǎn)生的，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的mFPR2水平明顯增多，表明微生物感染及前炎性重壓通過上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞mFPR2水平影響 AD的發(fā)病過程［28-29］。LPS通過與TLR4(toll-like receptor 4)結(jié)合激活小膠質(zhì)細(xì)胞。肽聚糖是源于革蘭陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁的一種特殊多聚體，也是一種前炎刺激物，它是僅知包含D-氨基酸的生物分子，是眾多抗生素抗體的靶目標(biāo)。對(duì)外源性病原入侵能做出初步免疫識(shí)別也是基于此共同結(jié)構(gòu)。PGN與LPS、TNF、肽聚糖識(shí)別蛋白(peptidoglycan recognition protein，PGRP)都能引起免疫反應(yīng)［30-31］。PGN 與 TLR2(toll-like receptor 2)結(jié)合激活小膠質(zhì)細(xì)胞［32］，參與免疫活動(dòng)。

MAPK，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究［33］證實(shí)，MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增生、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過程中具有至關(guān)重要的作用?？杀粦?yīng)激刺激(如紫外線、熱休克、高滲刺激及蛋白合成抑制劑等)、細(xì)胞因子(TNFα，IL-1)、生長(zhǎng)因子(NGF)及某些G蛋白偶聯(lián)的受體激活。

BV2細(xì)胞來源于鼠小膠質(zhì)細(xì)胞瘤，已經(jīng)廣泛被應(yīng)用來代替小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究。本研究選用PGN作為前炎刺激物，作用于BV2細(xì)胞及經(jīng)Aβ1-42寡聚體處理的BV2細(xì)胞，探討PGN對(duì)BV2細(xì)胞的影響及PGN引起B(yǎng)V2細(xì)胞對(duì)Aβ1-42寡聚體的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PGN處理后的BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ比未經(jīng)PGN處理后的BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ明顯增多(P＜0.01)，提示 PGN激活BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ增多，說明PGN作為前炎刺激物通過與TLR2(Toll-like Receptor 2)結(jié)合激活BV2細(xì)胞［32］，增加其吞噬功能，參與免疫活動(dòng)。

PGN通過什么機(jī)制激活BV2細(xì)胞?許多前炎刺激物可通過G蛋白偶聯(lián)人的FPRL1和他的鼠同系物mFPR2能介導(dǎo)Aβ1-42對(duì)髓細(xì)胞系(包括小膠質(zhì)細(xì)胞)的化學(xué)活性，PGN是否也通過mFPR2來激活BV2細(xì)胞的呢?我們用PGN處理后的BV2細(xì)胞后檢測(cè)mFPR2mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BV2細(xì)胞表達(dá)mFPR2 mRNA明顯增多，并且隨著PGN濃度增加，mFPR2 mRNA表達(dá)也增加。經(jīng)PGN 20 mg/L處理后BV2細(xì)胞表達(dá)mFPR2 mRNA增多，并且隨著PGN時(shí)間增加，mFPR2 mRNA表達(dá)也增加。從而證實(shí)PGN(TLR2激動(dòng)劑)激活TLR2促進(jìn)BV2細(xì)胞 G蛋白偶聯(lián)mFPR2的表達(dá)。很多研究［33］顯示在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增生、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過程中通過MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

此過程是否通過MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路呢?本研究用SB202190(p38MAPK抑制劑)預(yù)先處理BV2細(xì)胞再加入PGN，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入SB202190后PGN引起B(yǎng)V2細(xì)胞表達(dá)mFPR2 mRNA減少，隨著SB202190濃度增加，逐漸減少(P＜0.01)。提示PGN(TLR2激動(dòng)劑)激活TLR2促進(jìn)BV2細(xì)胞 G蛋白偶聯(lián)mFPR2的表達(dá)，通過MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

PGN激活BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ明顯增多與BV2細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)mFPR2的表達(dá)增多是否有關(guān)?本研究證實(shí)PGN誘導(dǎo)BV2細(xì)胞的mFPR2的表達(dá)與BV2細(xì)胞內(nèi)吞Aβ明顯增多有關(guān)。說明TLR2促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞與Aβ1-42相互反應(yīng)通過G蛋白偶聯(lián)mFPR2的誘導(dǎo)是AD關(guān)鍵的病理機(jī)制，與文獻(xiàn)［34］報(bào)道 TLR2是Aβ1-42激活小膠質(zhì)細(xì)胞關(guān)鍵受體相似。

除本實(shí)驗(yàn)證實(shí)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路外，最近發(fā)現(xiàn)PGN還可通過多個(gè)通路誘導(dǎo)多種致炎細(xì)胞因子的表達(dá)［35-36］，因此由PGN激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞Aβ1-42增加通過mFPR2表達(dá)可能有重要病理生理意義，為AD發(fā)病機(jī)制提供一定基礎(chǔ)研究證據(jù)。

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