閆 峰 劉向榮 張 營(yíng) 張陳誠(chéng) 吉訓(xùn)明 羅玉敏

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京 100053)

腦血管病具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，其中缺血性腦血管病的發(fā)病約占80%左右。目前關(guān)于腦缺血神經(jīng)損傷的保護(hù)研究很多［1－3］。多數(shù)基礎(chǔ)研究［4－5］表明缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血具有保護(hù)作用。缺血預(yù)適應(yīng)是在腦缺血之前給予非損傷性的缺血，大腦會(huì)產(chǎn)生對(duì)以后的嚴(yán)重缺血的保護(hù)。然而，由于疾病的不可預(yù)測(cè)性，科學(xué)家將視野轉(zhuǎn)向了缺血后適應(yīng)，簡(jiǎn)言之，與缺血預(yù)適應(yīng)相對(duì)應(yīng)，缺血后適應(yīng)是在腦缺血后給予腦一個(gè)非損傷的缺血適應(yīng)?！斑h(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)”即:器官發(fā)生缺血后，對(duì)遠(yuǎn)隔器官進(jìn)行短暫的、非致死性缺血和再灌注，可以減輕器官的缺血再灌注損傷。由于腦本身對(duì)缺血的敏感，很難控制其缺血適應(yīng)的程度，遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)更容易應(yīng)用于腦缺血的保護(hù)研究。已經(jīng)有研究［2－3，6－7］表明，缺血后適應(yīng)以及遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用。應(yīng)用大腦中動(dòng)脈閉塞模型發(fā)現(xiàn)，其功能缺損是神經(jīng)元核周體和有髓軸突損傷的共同反應(yīng)［8］。淀粉樣前體蛋白(β－amyloid precursor protein，β－APP)是一種廣泛存在于全身組織細(xì)胞，具有膜受體蛋白樣結(jié)構(gòu)的單跨膜蛋白［9］。近來(lái)，β－APP在缺血腦損傷中的表達(dá)以及作用機(jī)制受到越來(lái)越多地重視［10］。本文主要觀察了大鼠腦缺血后腦組織β－APP表達(dá)的變化以及遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血再灌注后β－APP表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量280～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司〔動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2006－2009〕。飼養(yǎng)于 SPF級(jí)動(dòng)物室，自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)前采用抽簽法隨機(jī)分為7組:①假手術(shù)組(S，n=4);② 缺血再灌注4 h組(C4，n=4);③缺血即刻后適應(yīng)4 h組(I4，n=4);④ 再灌注即刻后適應(yīng)4 h組(R4，n=4);⑤ 缺血再灌注24 h組(C24，n=4);⑥ 缺血即刻后適應(yīng)24 h組(I24，n=4);⑦ 再灌注即刻后適應(yīng)24 h組(R24，n=4)。

1.2 儀器

小動(dòng)物呼吸機(jī)(Harvard Apparatus 683)、雙極電凝(德威，DEVEL，ACC100)、顯微鏡(Carl Zeiss OpmI－pico)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(Harvard Apparatus)、血?dú)夥治鰞x(美國(guó)，Abbott公司，i－STAT)、有創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)儀(Siemens公司SC600C)、激光多普勒腦血流儀(Perimed，PeriFlux System 5000)顯微手術(shù)器械。

1.3 動(dòng)物模型制作

采用改良的ZeaLonga法制備大鼠腦缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。大鼠稱(chēng)體質(zhì)量后5%恩氟烷混合70%N2O、30%O2誘導(dǎo)麻醉，2%恩氟烷混合70%N2O、30%O2維持麻醉。頸正中切口分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，使用頭端直徑為0.38 mm的尼龍線栓由頸外動(dòng)脈殘端插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至距頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分叉處約18 cm，缺血時(shí)間為2 h。

使用反饋性控溫毯監(jiān)測(cè)大鼠肛溫，將大鼠體溫保持于36.5℃～37.5℃。分離大鼠尾動(dòng)脈插入PE50管持續(xù)監(jiān)測(cè)血壓和血?dú)?pH，PO2，PCO2)。術(shù)中使用激光多普勒監(jiān)測(cè)腦血流以確保模型的成功。

1.4 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)方法

分離大鼠雙側(cè)股動(dòng)脈主干，分別在缺血即刻和再灌注即刻使用動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈10 min，放開(kāi)10 min，重復(fù)3次。假手術(shù)組和對(duì)照組僅分離股動(dòng)脈，不夾閉。

1.5 免疫印跡

每組留取4只大鼠，在缺血再灌注4 h和24 h處死大鼠，留取缺血側(cè)腦組織。提取腦組織蛋白、測(cè)定蛋白濃度:腦組織于冰上加入裂解液，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行勻漿，冰浴30 min，以12 000 r/min于4℃離心30 min，取上清。根據(jù)BCA法參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，于560 nm處測(cè)定樣本的吸光度值(OA值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線計(jì)算各樣本的蛋白含量。配制8%分離膠和5%積層膠，取60 μg蛋白樣品溶于相應(yīng)體積的上樣液中，水浴鍋95℃～100℃加熱5 min，蛋白變性后即刻加樣。室溫下40 V電泳1 h，蛋白樣品到達(dá)分離膠后將電壓調(diào)為80 V，繼續(xù)電泳約3 h。配制電轉(zhuǎn)液，4℃下以60 V 120 min的條件下轉(zhuǎn)至預(yù)先用甲醇處理好的PVDF膜上。將膜置于TBST中清洗3次，每次10 min，置入5%脫脂牛奶中4℃封閉過(guò)夜。第2天將膜置入一抗中室溫孵育4 h，隨后TBST清洗3次，每次10 min，再置入二抗中室溫孵育1 h。抗體如下稀釋:抗 β－APP(1∶50，abcam 公司)、抗 actin(1∶2 000)、辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔(1∶2 000)?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)條帶。AlphaEaseFC軟件分析蛋白條帶的相對(duì)吸光度。

1.6 免疫熒光染色

每組留取4只大鼠，分別在缺血再灌注4 h和24 h處死大鼠，在大鼠腦模具中以視交叉開(kāi)始冠狀位向前及后各留取2 mm厚的腦組織，石蠟包埋，切片，進(jìn)行免疫熒光染色。步驟如下:腦組織切片依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇入水，0.3%的H2O2/甲醇溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，EDTA抗原微波熱修復(fù)12 min，小牛血清封閉非特異性抗原，4℃過(guò)夜;β－APP抗體(1∶50，Abcam 公司)，室溫 2 h;神經(jīng)元核抗原(Neuronal Nuclei，NeuN)抗體(1∶80，代表神經(jīng)元);神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(1∶200，代表膠質(zhì)細(xì)胞)，1×PBS漂洗 3次，每次 3 min;加 TRITC(tetramethylrhodamineisothiocyanate)山羊抗兔IgG，室溫30 min;1×PBS漂洗3次，每次3 min;DAPI(4'，6－diamidino－2－phenylindole)封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析，所有資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各數(shù)據(jù)組間比較使用單因素方差分析方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血β-APP含量的影響

圖1為各組大鼠的電泳圖。通過(guò)計(jì)算每個(gè)標(biāo)本β－APP與 β－actin的灰度比值，比較各組灰度比值(P=0.0201)。其中C24與I24兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其余各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血后β-APP含量影響的免疫印跡電泳圖Fig.1 The effects of remote ischemic post-conditioning on the level of β-APP in rats following cerebral ischemia

2.2 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血β-APP蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探討β－APP蛋白表達(dá)的部位，我們應(yīng)用免疫熒光雙染分別對(duì)β－APP/NeuN(代表神經(jīng)元)和β－APP/GFAP(代表膠質(zhì)細(xì)胞)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)β－APP可以與神經(jīng)元共表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)軸突也有表達(dá)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較少(圖3，4)。為證明抗體的特異性我們用了陰性對(duì)照。β－APP/GFAP的陰性對(duì)照同β－APP/NeuN的陰性對(duì)照，圖片未列出。

圖2 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血后β-APP含量影響的定量分析Fig.2 The quantitative determination of the effects of remote ischemic post-conditioning on the level of β-APP in rats following cerebral ischemia

3 討論

β－APP廣泛存在于全身組織細(xì)胞，以神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中含量較為豐富，正常情況下主要經(jīng)非淀粉樣蛋白生成途徑水解［9］，β－APP在神經(jīng)元中的主要作用是:①神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用;②促進(jìn)神經(jīng)元突起長(zhǎng)出和突觸發(fā)生作用;③ 對(duì)神經(jīng)興奮性和突觸可塑性的修飾［11］。β－APP在腦損傷時(shí)以淀粉樣蛋白生成途徑水解，產(chǎn)生Aβ。其可以直接激活補(bǔ)體系統(tǒng)，通過(guò)補(bǔ)體經(jīng)典途徑和形成膜攻擊復(fù)合體而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致再灌注損傷。APP的神經(jīng)毒性主要是通過(guò)異常水解產(chǎn)生的Aβ所激發(fā)的［9］。

β－APP是通過(guò)軸突快速轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制運(yùn)輸?shù)囊环N神經(jīng)元正常成分［9］，在正常神經(jīng)元中，它的表達(dá)水平很低，但在機(jī)械性損傷，缺血缺氧、興奮性毒素等引起的腦損傷后，β－APP可作為一種快速反應(yīng)性蛋白而誘導(dǎo)增高，或者由于β－APP的軸突運(yùn)輸被打斷而出現(xiàn) β－APP的聚集［9］。這種聚集由于缺血等損傷可引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基增加，Ca2+濃度異常升高。缺血狀態(tài)下，ATP合成減少，Na+－K+泵功能衰竭，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)反向轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致Glu的釋放［12］。突觸間隙Glu濃度增加，并過(guò)度激活谷氨酸受體，尤其是NMDA受體。激發(fā)的氧化損傷等病理過(guò)程又可能活化β－分泌酶促進(jìn)β－APP裂解，增加Aβ的產(chǎn)生和聚集。這些過(guò)程間形成了惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和變性［13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管大鼠腦缺血4 h以及24 h時(shí)，缺血腦組織β－APP水平與假手術(shù)組相比，P值均小于0.05，但從數(shù)值看，大鼠腦缺血再灌注后4 h β－APP水平未升高，24 h有升高，提示大鼠局灶性腦缺血模型中缺血腦組織β－APP的聚集在缺血后24 h開(kāi)始，因此相關(guān)的保護(hù)治療可以在腦缺血24 h前開(kāi)始。本實(shí)驗(yàn)中缺血即刻給予遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)組在24 h時(shí)缺血腦組織β－APP的水平顯著低于對(duì)照組，提示，遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)可能通過(guò)干預(yù)β－APP的水平從而減少Aβ的產(chǎn)生和聚集，減少腦組織的損傷。最近有報(bào)道［14－16］，腦缺血后 β－APP 的表達(dá)變化與時(shí)間以及 Aβ的多少有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)提示我們應(yīng)該注意神經(jīng)元以外的白質(zhì)損傷，通過(guò)實(shí)施遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)可能會(huì)降低腦缺血后β－APP水平的升高，從而減少缺血再灌注損傷。對(duì)非生命重要器官實(shí)施遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)，來(lái)保護(hù)已經(jīng)發(fā)生缺血的生命重要器官，避免了對(duì)心、腦等生命重要器官直接實(shí)施缺血保護(hù)帶來(lái)的高風(fēng)險(xiǎn)，此種方法對(duì)于臨床應(yīng)用具有重要意義。

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