中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科(沈陽 110001) 李良滿 李靜波 朱 悅

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)繼發(fā)性損傷機制復雜,目前臨床上還缺乏更多有效的治療藥物。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn),補體系統(tǒng)在 SCI中起到了重要作用,抑制補體系統(tǒng)激活可以減輕繼發(fā)性 SCI[1]。近幾年來,SCI的抗補體治療越來越引起人們的關注。而開發(fā)尋找高效、安全、低成本的補體抑制劑亦成為相關研究熱點和方向[2]。草麻黃(Ephedra sinica,ES)較早地被應用于急性腎炎、支氣管哮喘等與免疫炎癥反應相關疾病的治療中,獲得了顯著的療效,其作用機制被認為與抑制補體活化有關[3]。隨著生物化學技術的不斷發(fā)展,其抗補體成分已被成功的分離提取,并被證明具有強力的補體抑制作用[4]。本研究首次將草麻黃補體抑制成分應用于實驗性的 SCI治療中,探討其對SCI后補體系統(tǒng)激活的影響,為 SCI的抗補體治療提供更多的理論依據(jù)。

材料和方法

1 草麻黃補體抑制成分的提純及活性鑒定 參照 Ling等的方法應用多步沉淀及薄層層析方法進行草麻黃補體抑制成分的提純并進行活性鑒定,1kg草麻黃加入 pH4.0的蒸餾水 10L,煮沸 1h,過濾除渣,加入 1mol/L NaOH調(diào)整 pH至 9.0室溫攪拌孵育 1h,離心,洗滌沉淀 3次,室溫烘干得到棕褐色粗品共 18.5g。取 3g粗品溶于 pH4.0的蒸餾水 50ml中,煮沸 1h,離心棄上清,溶于 pH 9.0的蒸餾水中,調(diào)整 pH值至4.0,進行薄層層析,微量法進行補體溶血實驗測定,結果證明最快速移動層析帶具有顯著的抗補體活性。重復以上步驟進行提取收集備用。

2 實驗動物分組及脊髓損傷模型制備 健康 SD大鼠 50只,SPF級,雌雄不拘,體重 250～ 300g,隨機分組:①實驗組 (ES組):分脊髓損傷后 12h、1d、3d、7d、14d五個時間點,每個時間點 n=5,傷后 1h給予ES補體抑制成分提取物 (15mg/kg)溶于 5ml生理鹽水強制灌胃,1次 /d。② 對照組(Control組):分脊髓損傷后 12h、1d、3d、7d、14d五個時間點,每個時間點 n=5,以同樣方法給予等量生理鹽水。采用改良的Allen’s重物打擊法[5]方法制備大鼠脊髓急性損傷模型:損失部位為 T10節(jié)段。

3 血清總補體溶血活性測定 應用 CH50法進行血清總補體溶血活性測定。在大鼠 SCI前 1h、傷后12h及傷后每天尾靜脈抽血 0.3ml,離心,取上清,-20℃保存?zhèn)溆?。制?2%綿羊紅細胞懸液,溶血素效價測定,制備 50%溶血標準管,然后將各濃度梯度反應體系置于微量板孔中,反應完畢后,在 541nm波長處測吸光度,計算出待測血清的 CH50值,并與損傷前血清樣品的基礎值比較,計算出百分比值。

4 組織病理學觀察 各組動物于傷后每個時間點各取 3只再次麻醉,以傷處為中心取 1cm脊髓組織,制作片厚為 12 μ m的冰凍切片,分別行 HE染色及免疫組織化學染色。采用 SABC法進行 C3、C9免疫組化染色。試劑盒購自美國 Sigma公司。光學顯微鏡下,C3及 C9陽性反應物為突出背景的棕黃色顆粒。應用Meta Morph全自動真彩色圖像分析儀測定 C3、C9陽性反應物平均灰度值(Average gray value,AG)。 AG與陽性反應物的免疫反應強度呈反比關系。

結 果

1 血清 CH50測定結果 在實驗組和對照組,傷后早期血清 CH50比值迅速下降,約在傷后 1d達到最低值,分別 29.05% ± 2.08%,24.08% ± 2.31%;傷后 3d至 7d快速上升,以后緩慢回升,在傷后 14d,對照組 CH50接近傷前水平(98.21% ± 1.12%),而在實驗組僅達到傷前的 75%左右。在傷后 12h實驗組的 CH50比值均低于對照組,具有顯著性差異(P＜0.05),而在此后的幾個時間點,實驗組的 CH50比值均明顯低于對照組(P＜0.01)。

2 組織病理學檢查結果 傷后 12h,實驗組及對照組脊髓前角部分神經(jīng)元細胞膜上有散在的 C3及 C9陽性顆粒沉積;傷后 3d:兩組整個灰質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有大量 C3及 C9陽性顆粒沉積,其中殘存陽性神經(jīng)元的胞膜及胞漿內(nèi)均可見 C3及 C9陽性顆粒沉積;傷后 7d,兩組灰質(zhì)內(nèi)仍有一定數(shù)量 C3及 C9陽性神經(jīng)元,部分神經(jīng)元已基本恢復了多角形態(tài);損傷后 14d兩組灰質(zhì)內(nèi)仍可見 C3及 C9陽性表達。

3 圖像分析結果 在傷后各個時間點,實驗組脊髓損傷組織中 C3及 C9 AG值均高于對照組,且有非常顯著性差異(P＜0.01),表明實驗組 C3及 C9陽性表達明顯弱于對照組;傷后 3d約是補體免疫反應的高峰,見附表。

附表 傷后不同時間點 ES組及 Control組 C3、C9表達圖像分析結果 (AG

附表 傷后不同時間點 ES組及 Control組 C3、C9表達圖像分析結果 (AG

注:與 Control組比較,* P＜0.01

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討 論

補體系統(tǒng)是構成機體免疫防護機制的重要組成部分,也是造成病理性損傷的重要因素。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時存在補體系統(tǒng)激活的必要條件。補體系統(tǒng)重要固有成分 C3處于經(jīng)典途徑、旁路途徑及 MBL途徑的匯合點,在補體系統(tǒng)激活過程中起著樞紐作用。 C9是形成膜攻擊復合體(Membrane attack complex,MAC)的最后一個分子,也是補體系統(tǒng)激活并攻擊破壞靶細胞的主要成分[6]。

補體系統(tǒng)激活后,會通過多種機制導致組織細胞的病理性損傷。其中 MAC所介導的神經(jīng)元死亡包括壞死和凋亡兩個方面。當 M AC攻擊靶細胞膜時,在靶細胞膜上可形成小的雙向的跨膜通道,引起 Ca2+不可抑制性地大量內(nèi)流以及細胞內(nèi) K+外流、Na+通透性增加等變化,導致膜磷脂的過氧化,加重血管痙攣、組織缺血,神經(jīng)元細胞傳導沖動的能力減弱或喪失。 MAC還可以通過激活和裂解 caspase途徑而誘導細胞調(diào)亡,從而加重繼發(fā)性 SCI[7]。

近年來大量研究表明,抑制補體系統(tǒng)激活可以減輕 SCI后的繼發(fā)性損傷,抗補體治療有望成為 SCI新的治療策略。 Reynolds[8]等研究發(fā)現(xiàn)痘病毒補體調(diào)控蛋白能夠顯著抑制大鼠 SCI后的補體表達,減輕 SCI。Qiao等研究表明,補體經(jīng)典途徑與旁路途徑在脊髓損傷中起到重要作用,補體抑制劑 CR2-Crry能夠顯著地減輕小鼠 SCI后的神經(jīng)功能損害,抑制補體激活可減輕繼發(fā)性 SCI[9,10]。Tei等[11]研究發(fā)現(xiàn),補體 C1酯酶抑制劑能夠顯著抑制補體系統(tǒng)激活,保護神經(jīng)功能。Guo等[12]研究發(fā)現(xiàn),C3缺失小鼠傷后神經(jīng)元再生功能要顯著優(yōu)于 C3未缺失小鼠,抑制補體激活可減輕繼發(fā)性SCI。我們研究發(fā)現(xiàn),重組補體抑制劑 sCR1可顯著抑制大鼠脊髓損傷后的補體激活,對神經(jīng)功能發(fā)揮顯著的保護作用。

本研究首次將 ES補體抑制成分提純后應用于大鼠的 SCI模型研究中。結果表明,在實驗組及對照組的SCI組織中均有重要補體固有成分 C3及 C9的表達,并且實驗組的血清 CH50比值、損傷組織中的 C3及C9表達均明顯低于對照組,表明 ES補體抑制成分能夠顯著抑制補體系統(tǒng)的激活,對脊髓損傷后的神經(jīng)功能可能發(fā)揮重要的作用,在今后的研究中我們將進一步深入探討。本研究為 SCI的抗補體治療提供了新的實驗數(shù)據(jù)及理論基礎。

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