王君,韓靜

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院,山西太谷 030801)

芽孢桿菌是經(jīng)常遇到的污染菌,而且有的還是致病菌;它們可以引起果蔬、糧食、乳制品、肉類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、禽類(lèi)、蛋類(lèi)以及罐頭食品的變質(zhì)和一些食源性疾病和食物中毒[1,2]。如:蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)污染牛乳后可使其酸度不高時(shí)即可發(fā)生凝固,而且產(chǎn)生下痢疾毒素、腸毒素、溶血素、嘔吐毒素及腸管壞死毒素等引起食物中毒。巨大芽孢桿菌(B.megaterium)可使?jié)饪s乳凝固并產(chǎn)生干酪味的氣味,使肉類(lèi)罐頭變質(zhì)脹罐。肉類(lèi)罐裝食品中最重要的是肉毒梭狀芽孢桿菌(Cl.botulinum),其芽孢耐熱性極強(qiáng),能產(chǎn)生很強(qiáng)的毒素——肉毒毒素,人們食入含有該毒素的食品可發(fā)生毒素型食物中毒,早期癥狀為全身無(wú)力、頭痛、頭暈,繼而出現(xiàn)眼瞼下垂、視力模糊、瞳孔散大、吞咽困難等癥狀直至死亡。

由于芽孢具有高度抗逆性,因此殺滅芽孢成為衡量各種消毒滅菌手段的最重要的指標(biāo)。大量的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和食品研究資料都證實(shí),大蒜對(duì)芽孢桿菌屬有明顯的抑制效果。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于對(duì)芽孢桿菌屬的抑制作用大多集中于對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抑制作用研究上,較少關(guān)注芽孢。故本試驗(yàn)采用大蒜原汁為材料研究其對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢形成和芽孢發(fā)芽的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis AS 1.1380)。

紫皮大蒜(Allium sativum L.),購(gòu)于陜西省岐山縣蔡家坡。

磷酸氫二鈉,磷酸二氫鉀,冰乙酸,乙酸鈉,硫酸亞鐵銨,抗壞血酸,均為分析純。

蛋白胨,酵母浸膏,瓊脂,均為生化試劑。

2,6-吡啶二羧酸色測(cè)反應(yīng)劑[3]:pH5.5,0.5 mol?L-1乙酸鈉緩沖液100 mL,抗壞血酸、硫酸亞鐵銨各1 g,每次實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)配。

大蒜原汁制備:將大蒜洗凈,去皮,用壓榨機(jī)壓榨,無(wú)菌濾紙過(guò)濾,取出原汁,置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌的顯微鏡鏡檢

當(dāng)芽孢桿菌的細(xì)胞停止生長(zhǎng)時(shí),就開(kāi)始形成芽孢。通過(guò)顯微鏡芽孢染色[4]觀察細(xì)菌不同時(shí)間生長(zhǎng)期的形態(tài)變化,以確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期每一個(gè)階段的具體時(shí)間,從而間接確定其芽孢形成的開(kāi)始時(shí)期,為芽孢形成的試驗(yàn)提供可靠數(shù)據(jù)。

1.2.2 蒜汁對(duì)B.subtilis芽孢形成[5]影響

分別將菌懸液配成106cfu?mL-1和104cfu?mL-1兩個(gè)稀釋度作對(duì)比試驗(yàn),按接種量0.5%接入液體培養(yǎng)基培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)液中細(xì)菌處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(11 h)時(shí),將大蒜原汁按不同濃度加入到培養(yǎng)液中,37℃培養(yǎng)不同時(shí)間,取出后立即在80℃條件下加熱10 min,殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,再進(jìn)行梯度稀釋,用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[6]。

1.2.3 蒜汁對(duì)2,6-吡啶二羧酸(DPA)的影響

取試驗(yàn)1.2.2中經(jīng)過(guò)大蒜汁處理的菌懸液混合液(106cfu?mL-1稀釋度)5 mL,立即離心(3000 r?min-1)30 min分離菌體,加5 mL無(wú)菌水,在 121 ℃加熱30 min,冷卻后加入1 mol?L-1醋酸0.1 mL,室溫下靜置1 h,再離心(3000 r?min-1)30 min,往4 mL上清液中加1 mL的DPA色測(cè)反應(yīng)劑,于440 nm下測(cè)定其OD值[3]。

1.2.4 蒜汁濃度對(duì)B.subtilis芽孢發(fā)芽[5]的影響

取制備好的芽孢懸液[7](104cfu?mL-1)一定量,于80℃加熱10 min熱激活芽孢后,迅速冰水冷卻,在不同發(fā)芽時(shí)間與不同濃度大蒜汁中孵化30 min,梯度稀釋后,用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[6]。

1.2.5 蒜汁處理B.subtilis的時(shí)間對(duì)其芽孢發(fā)芽[5]的影響

用試驗(yàn)1.2.4的方法將芽孢熱激活后,迅速冰水冷卻,在不同發(fā)芽時(shí)間與濃度為1%的大蒜汁處理不同時(shí)間,用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[6]。

2 結(jié)果和分析

2.1 枯草芽孢桿菌的顯微鏡鏡檢結(jié)果

通過(guò)對(duì)比開(kāi)始形成芽孢時(shí)期和芽孢發(fā)芽后的鏡檢圖(圖1和圖2),確定培養(yǎng)枯草芽孢桿菌11 h時(shí),是芽孢形成的開(kāi)始時(shí)期。

將制備好的芽孢懸液進(jìn)行芽孢染色鏡檢,以確定芽孢懸液中無(wú)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖3。鏡檢結(jié)果表明制備的芽孢懸液已無(wú)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,可用于芽孢發(fā)芽的試驗(yàn)。

圖1 開(kāi)始形成芽孢時(shí)期的鏡檢圖(11 h)Fig.1 Micrograph of beginning sporulation(11 h)

圖2 芽孢形成后的鏡檢圖(15 h)Fig.2 Micrograph of sporulation(15 h)

圖3 芽孢懸液鏡檢圖Fig.3 Micrograph of spore suspension

2.2 蒜汁對(duì)B.subtilis芽孢形成的影響

從圖4可以看出,當(dāng)蒜汁濃度為1%,菌懸液濃度為104cfu?mL-1時(shí),其抑制時(shí)間持續(xù)到48 h時(shí)仍有一定的抑制性,平板菌落數(shù)與空白對(duì)照相差10倍。從圖5中可以看出,當(dāng)菌懸液濃度為106cfu?mL-1時(shí)的各大蒜汁處理液與菌作用時(shí)間超過(guò)24 h后,這種抑制作用消失,結(jié)果都與空白一致。綜合分析可知,大蒜汁對(duì)枯草桿菌的芽孢形成有重要影響作用。在大蒜汁與菌作用時(shí)間相對(duì)較短時(shí),大蒜汁濃度越高,芽孢形成的數(shù)量越少,其抑制芽孢形成的時(shí)間越長(zhǎng)。

圖4 蒜汁對(duì)芽孢形成的影響/104cfu?mL-1Fig.4 Effectofsporulation on sensitivity of B.subtilis to garlic juice

圖5 蒜汁對(duì)芽孢形成的影響/106cfu?mL-1Fig.5 Effectofsporulation on sensitivity of B.subtilis to garlic juice

2.3 蒜汁對(duì)2,6-吡啶二羧酸(DPA)的影響

DPA是芽孢中的一種重要物質(zhì),在芽孢形成的后期才合成,其含量一定,很少隨培養(yǎng)條件的變化而變化[8],故可通過(guò)DPA濃度的變化間接衡量成熟芽孢數(shù)量的多少。從圖6試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)大蒜汁處理過(guò)的枯草芽孢桿菌中芽孢所含DPA量的變化趨勢(shì)比空白對(duì)照晚12 h。綜上分析,大蒜汁對(duì)枯草芽孢桿菌的芽孢形成影響主要是延緩了芽孢的形成過(guò)程。這也很好的解釋了結(jié)果與分析中2.2的結(jié)論。

圖6 DPA含量的測(cè)定Fig.6 Determination of quantification of DPA

2.4 蒜汁濃度對(duì)B.subtilis芽孢發(fā)芽的影響

結(jié)果如表 1所示,將處理后的混合液取0.1 mL涂平板發(fā)現(xiàn),活菌菌落數(shù)與對(duì)照相當(dāng),沒(méi)有差異性。在芽孢發(fā)芽的120 min內(nèi),濃度高達(dá)10%的大蒜汁都對(duì)芽孢發(fā)芽沒(méi)有顯著性影響。

表1 蒜汁濃度、發(fā)芽時(shí)間對(duì)芽孢發(fā)芽的影響Table 1 The number of CFU at different germination time and concentrations of garlic juice

2.5 蒜汁處理B.subtilis的時(shí)間對(duì)其芽孢發(fā)芽的影響

結(jié)果如表2所示,在芽孢發(fā)芽的120 min內(nèi),處理時(shí)間長(zhǎng)達(dá)120 min都對(duì)芽孢發(fā)芽沒(méi)有任何影響,將處理后的混合液取0.1 mL涂平板發(fā)現(xiàn),活菌菌落數(shù)與對(duì)照相當(dāng),沒(méi)有差異性。

通過(guò)考察不同蒜汁濃度、不同發(fā)芽時(shí)間、不同抑制處理時(shí)間三個(gè)因素之間的二因素試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)這三個(gè)因素都對(duì)芽孢的發(fā)芽沒(méi)有影響,試驗(yàn)結(jié)果與空白對(duì)照相比無(wú)顯著性差異,說(shuō)明大蒜汁并不影響芽孢的發(fā)芽。

表2 處理時(shí)間、發(fā)芽時(shí)間對(duì)芽孢發(fā)芽的影響Table 2 The number of CFU at different treatment time and germination time with concentration of garlic juice

3 結(jié)論與討論

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),大蒜汁對(duì)B.subtilis芽孢和DPA的形成有重要作用,其影響主要是延緩了芽孢的形成過(guò)程,且隨著大蒜汁濃度的增加,對(duì)形成芽孢的影響也越大,其抑制芽孢形成的時(shí)間越長(zhǎng)。大蒜汁對(duì)芽孢的發(fā)芽影響作用不大,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2 h,濃度高達(dá)10%的大蒜汁對(duì)芽孢的發(fā)芽沒(méi)有顯著影響。這可能是由于大蒜所含有效成分的硫原子與細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所必需的半胱氨酸分子中的巰基相結(jié)合而抑制其生長(zhǎng)和繁殖,其作用機(jī)制是與影響半胱氨酸蛋白酶活性的幾種酶如脫氫酶、硫氧還蛋白還原酶、RNA聚合酶等上面的巰基結(jié)合,抑制了其活性[9]。芽孢形成的過(guò)程中,特別是在芽孢衣層形成外衣時(shí),芽孢中半胱氨酸顯著增加。半胱氨酸是由谷胱苷肽在水解酶活性增強(qiáng)作用下水解而來(lái)的[10],這對(duì)芽孢外衣形成是必需的;由于合成半胱氨酸受阻,從而可能改變了細(xì)菌細(xì)胞乃至芽孢的通透性,導(dǎo)致細(xì)菌芽孢壁層結(jié)構(gòu)的不完整,這也解釋了大蒜汁對(duì)形成芽孢的影響試驗(yàn);而芽孢發(fā)芽的過(guò)程非常短,熱激活后芽孢衣中半胱氨酸已經(jīng)變性,芽孢透性增加,開(kāi)始自然裂解和下一代營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng),此時(shí)加入大蒜汁處理2 h內(nèi),大蒜汁無(wú)作用效果。關(guān)于此現(xiàn)象原因并未在國(guó)內(nèi)外報(bào)道中發(fā)現(xiàn),有待于進(jìn)一步研究。此外,大蒜對(duì)于芽孢的作用機(jī)理目前并無(wú)統(tǒng)一認(rèn)識(shí),也有待于進(jìn)一步研究。

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