張永娟,韓 蕊,原 燁,梁 虹,馮子蓉,戎郁萍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，北京 100193)

羅布麻(Apocynumvenetum)是夾竹桃科羅布麻屬中具有重要生態(tài)價值和經(jīng)濟價值的多年生草本植物[1]，耐旱、耐寒、耐鹽堿、耐風(fēng)沙，生長在山溝、岸邊、干旱沙漠或內(nèi)陸盆地、海濱鹽堿低濕地[2]。羅布麻可在極端惡劣的環(huán)境下生存，在最低溫度-47 ℃的新疆北部阿勒泰地區(qū)能夠安全越冬；在我國最熱地區(qū)吐魯番盆地夏天溫度達(dá)47 ℃時依舊生長良好[3]。近年來，關(guān)于羅布麻的研究大多集中在抗鹽、醫(yī)藥應(yīng)用、纖維紡織利用等領(lǐng)域[4-5]，關(guān)于羅布麻種子的適應(yīng)性及劣變規(guī)律的研究較少。

種子是蘊藏著生命力的植物器官，它和一切活的有機體一樣，同外界環(huán)境構(gòu)成不可分割的統(tǒng)一整體[6]。種子活力水平主要受遺傳因子和外界因素的制約[7]。環(huán)境對種子劣變影響很大。在自然老化條件下，種子內(nèi)部發(fā)生一系列的生理生化變化，生理變化表現(xiàn)為種子萌發(fā)緩慢，萌芽力下降，耐逆境能力減弱；生化方面表現(xiàn)為超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性、貯藏性物質(zhì)、合成能力、呼吸作用、有毒物質(zhì)含量和遺傳物質(zhì)變異等多方面的變化[6]。種子在普通貯藏條件下老化非常緩慢，很難在較短的時間內(nèi)測定種子活力。加速老化能夠克服這個缺點，使種子活力差別在較短時間內(nèi)表現(xiàn)出來[8]。在人為控制條件下，將種子短期內(nèi)放在高溫和高濕環(huán)境中，從潮濕的環(huán)境中吸水，可提高種子含水量，伴隨高溫導(dǎo)致種子迅速老化[9]。老化不僅影響種子萌發(fā)及幼苗生長，也影響后期植株的品質(zhì)和產(chǎn)量[10]。目前，國內(nèi)外關(guān)于種子老化及劣變機理的報道很多。老化在茄子(Capsicoidesallioni)、黃瓜(Cucumissativus)、辣椒(Capsicumannuum)等蔬菜種子中研究已較普遍[11-13]。糧食作物方面，覃鵬等[14]、劉明久等[15]分別研究了人工老化對小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)生理生化特性的影響。在牧草種子研究中也已開展了相關(guān)研究[16-18]。但不同植物種子對老化要求的條件不同，生理生化特性的表現(xiàn)也不盡相同，因此需要進一步研究不同植物在老化條件下的生理生化特性的變化規(guī)律。

本研究以羅布麻種子為試驗材料，采用人工加速老化法，對其老化過程中的生理生化特性變化規(guī)律進行初步研究，探討老化條件下種子活力的劣變規(guī)律，分析其在自然生態(tài)環(huán)境中活力喪失的機制，對合理貯藏種子，以保持或提高種子活力提供理論依據(jù)，也對羅布麻資源的開發(fā)利用具有積極意義。

1 材料與方法

1.1試驗材料 2009年采集于新疆巴州地區(qū)尉犁縣的羅布紅麻種子。

1.2試驗方法

1.2.1人工加速老化處理 老化方法參照王玉紅等[19]的方法加以調(diào)整。選取潔凈種子鋪于裝有蒸餾水的老化盒內(nèi)干燥篩網(wǎng)上，水面距種子約1 cm。放入設(shè)定溫度的老化箱內(nèi)。老化箱上放置一水源，確保老化期間濕度為100%。老化溫度設(shè)定為35、50 ℃，分別進行12、24、36、60和84 h的人工老化處理，以未經(jīng)加速老化處理的種子為對照，分期取出老化種子，攤晾使其恢復(fù)至原質(zhì)量后進行生理生化指標(biāo)的測定。

1.2.2電導(dǎo)率測定 參照徐本美和韓建國[20]方法，稱取處理后種子0.1 g，重復(fù)4次，先用清水沖洗3次，再用去離子水沖洗2次，將種子表面的浮水用濾紙擦干，放入100 mL三角瓶中，同時設(shè)一對照，加入30 mL去離子水，用錫箔紙封口后在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h，用DDS-Ⅱ型電導(dǎo)儀測定浸出液的電導(dǎo)率。

1.2.3脫氫酶活性測定 參考陶梅和辛萍萍[21]的方法，稱取各處理種子0.1 g，4次重復(fù)，浸泡于蒸餾水中在20 ℃條件下放置24 h，用濾紙吸干浮水，小心剝除種皮，用0.1%TTC在38 ℃恒溫條件下黑暗染色3 h，達(dá)到反應(yīng)時間后倒出TTC溶液，用蒸餾水將種子洗凈，用濾紙吸干表面浮水，將染色的胚放入具塞試管內(nèi)，加入95%酒精10 mL，然后在35 ℃恒溫箱中提取24 h，達(dá)規(guī)定時間后提取液于490 nm處以95%酒精做空白測吸光度值，以光密度OD值的大小表示脫氫酶活性的高低。

1.2.4POD活性測定 參照李玲[22]方法。酶粗提液提取：稱取種子0.2 g，3次重復(fù)，加入6 mL 50 mmol/L的pH值7.8的磷酸緩沖液，于研缽中研磨成勻漿，4 000 r/min離心15 min，收集上清液低溫保存。

活性測定：比色杯中加入3 mL反應(yīng)液和1 mL磷酸緩沖液作為對照，間隔2 min讀值。POD活性[U/(g·min)]=(ΔA470·VT)/(W·VS·0.01×t)。ΔA470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光值變化；W為種子質(zhì)量(g)；t為反應(yīng)時間(min)；VT為提取酶液總體積(mL)；VS為測定時取用的酶液體積(mL)。

1.2.5浸出液可溶性糖含量測定 參照黃學(xué)林和陳潤政[23]的方法，稱取0.1 g處理種子，3次重復(fù)，將種子放在20 ℃條件下用100 mL蒸餾水浸泡24 h，然后吸取浸提液1 mL，放入干凈的試管中，各加入5 mL蒽酮試劑，小心振蕩使其混合均勻。在沸水浴中保溫10 min冷卻，以對照調(diào)零在620 nm波長測定光密度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求可溶性糖的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取0.1 g無水葡萄糖溶先用蒸餾水定容至1 000 mL，此為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液。由母液配制成的每毫升含葡萄糖0、20、40、60、80、100 μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，再加入5 mL蒽酮試劑(0.2 g蒽酮溶于100 mL 76%稀硫酸中)充分混合均勻，放入100 ℃水浴鍋中加熱10 min，自然冷卻后，以空白為對照，在620 nm處測定吸光值，根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，用新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1老化處理對羅布麻種子浸出液電導(dǎo)率的影響 隨著老化溫度的提高和老化時間的延長，羅布麻種子的電導(dǎo)率在初期平緩下降后逐漸上升，并在老化后84 h達(dá)到最高值。在相同老化溫度下，隨著老化時間的延長，電導(dǎo)率急劇上升(圖1)。

圖1 人工加速老化處理對種子電導(dǎo)率的影響

在老化初期12和24 h羅布麻種子的電導(dǎo)率與對照相比均出現(xiàn)下降趨勢(圖1)，且35 ℃與50 ℃老化處理電導(dǎo)率基本持平，都與對照之間差異不顯著(P>0.05)。盡管36 h老化處理后種子電導(dǎo)率增加，但與對照相比差異不顯著。從老化處理60 h后，種子電導(dǎo)率比對照顯著提高(P<0.05)。50 ℃老化條件下的電導(dǎo)率增幅高于35 ℃，50 ℃老化處理60、84 h的電導(dǎo)率比35 ℃老化處理的電導(dǎo)率分別高7.64%和16.09%。說明隨著種子老化程度的加劇，膜系統(tǒng)受到破壞，且溫度越高破壞性越大，細(xì)胞內(nèi)的礦物質(zhì)和無機物質(zhì)外滲，導(dǎo)致電導(dǎo)率升高。

2.2老化處理對羅布麻種子脫氫酶活性的影響 隨著老化時間的延長，脫氫酶活性均呈下降趨勢(圖2)。35 ℃老化條件下下降趨勢較為平緩，50 ℃在老化初期就急劇下降。在各處理時期35 ℃老化條件下脫氫酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于50 ℃，50 ℃老化條件下在處理36 h以后脫氫酶活性變?yōu)?。各處理與對照相比均差異顯著(P<0.05)。脫氫酶在種子萌發(fā)過程中起非常重要的作用，其活性的下降反映了種子萌發(fā)能力的下降[24]。說明，脫氫酶活性對老化處理反應(yīng)比較敏感，溫度越高對脫氫酶活性影響越大，在高溫老化條件下短期內(nèi)即可失活。

圖2 人工加速老化處理對種子脫氫酶活性的影響

2.3老化處理對羅布麻種子過氧化物酶活性的影響 POD活性均隨著老化時間的延長而逐漸下降(圖3)，老化初期(0～12 h)，POD活性迅速降低，老化后期下降速度趨于平緩。不同處理之間POD活性下降趨勢有所不同，在整個處理期間POD活性50 ℃明顯高于35 ℃。其中，在50 ℃老化條件下，處理12 h后隨處理時間延長呈微升趨勢，但是各處理(12、24、36、60、80 h)之間差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于對照(P<0.05)。35 ℃老化條件下，各處理均顯著低于對照，處理12 h顯著高于其他處理，24、36、60、80 h處理之間差異不顯著。結(jié)果表明，羅布麻種子POD活性在老化初期都會有不同程度地下降，隨后變化趨勢趨于平穩(wěn)。POD是清除活性氧的抗氧化酶之一，POD 活性的下降使種子中超氧化物陰離子自由基的含量積累增加，加大了對種子的毒害作用。

圖3 人工加速老化處理對種子過氧化物酶活性的影響

2.4老化處理對羅布麻種子浸出液可溶性糖含量的影響 在高溫高濕老化過程中，相同溫度下羅布麻種子浸出液中可溶性糖含量隨著老化時間的延長逐漸增加；相同老化時間下，溫度越高，浸出液可溶性糖含量上升趨勢越大(圖4)。在整個處理過程中50 ℃處理種子可溶性糖含量一直高于35 ℃處理種子，84 h時都達(dá)到最大值，分別為82.97和65.63 μg/mL。

老化初期(0～24 h)可溶性糖含量上升比較緩慢。隨著老化的進行，在35 ℃條件下，24～36 h階段可溶性糖含量增速明顯加快；在50 ℃條件下，24～36和60～84 h階段可溶性糖增速明顯加快(圖4)。除12 h處理與對照相比差異不顯著外，其他各處理與對照相比差異均顯著(P<0.05)。說明，種子可溶性糖含量均在老化24 h后顯著增加，與電導(dǎo)率變化有相似特征，可能是由于在老化初期種子經(jīng)過短暫自我修復(fù)，膜的傷害程度相對較小，可溶性糖作為電導(dǎo)率浸出液的成分之一，影響較小。在處理后期，質(zhì)膜的透性增大，種子受傷害的程度增加，可溶性糖量損失增加。

圖4 老化處理對種子可溶性糖含量的影響

3 討論

植物細(xì)胞膜對物質(zhì)具有選擇通透性。質(zhì)膜是植物在逆境脅迫中首先受到傷害的原初位點[25]。植物組織受到傷害，膜的結(jié)構(gòu)受損，膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)各種水溶性物質(zhì)將外滲，此時將植物組織浸入去離子水中，水的電導(dǎo)率將因電解質(zhì)的外滲而加大。傷害愈重，外滲愈多，電導(dǎo)率的增加也愈大，故可通過測定外液電導(dǎo)率增加值得知膜傷害程度[26]。近年來關(guān)于質(zhì)膜受損這一植物生理指標(biāo)在種子老化裂變期間的研究越來越多[27-28]。40 ℃加速老化處理下，2種小麥種子的電導(dǎo)率隨著老化處理時間的延長先降后升，因此,在輕度老化條件下植物抗逆性增加，減小了細(xì)胞膜的受損程度[26]。穆瑞霞[29]在人工老化與引發(fā)對大蔥(Alliumfistulosum)種子活力及幼苗生理生化變化的影響中發(fā)現(xiàn),種子浸出液的電導(dǎo)率在出現(xiàn)短暫下降后升高，認(rèn)為隨著老化的進行膜系統(tǒng)經(jīng)過短暫的自我修復(fù)，電導(dǎo)率下降，之后由于高溫高濕老化程度的加重，膜系統(tǒng)受損嚴(yán)重電導(dǎo)率升高。然而在老化過程中，不同材料的電導(dǎo)率并不都是先降低后升高的。李玉榮等[17]在人工加速老化藍(lán)莖冰草(Agropyronsmithii)種子中發(fā)現(xiàn),電導(dǎo)率隨老化時間的延長逐漸降低，這可能是由種子組成導(dǎo)致的。在牧草種子中，羊草(Leymuschinensis)、新麥草(Psathyrostachysjuncea)、高羊茅(Festucaelata)、紫花苜蓿(Medicagosativa)老化研究中種子電導(dǎo)率則隨老化的進行一直上升[30-33]。本研究得出電導(dǎo)率隨著老化時間的延長在老化初期下降緩慢，這可能是由于羅布麻種子本身耐熱性較強在初期高溫環(huán)境中抗逆機制導(dǎo)致電導(dǎo)率降低；而后逐漸增大，且老化條件越高對種子傷害程度越大，膜的透性增大造成與代謝有關(guān)的各種物質(zhì)外滲，電導(dǎo)率可以反映種子劣變情況，可以作為測定羅布麻種子老化生理指標(biāo)之一。

脫氫酶是測定種子生活力的重要指標(biāo)之一，在呼吸過程中起重要作用，其可以快速地體現(xiàn)種子胚的還原能力。在本研究中，50 ℃老化處理比在35 ℃老化處理下脫氫酶活性喪失速度快且在36 h以后活力就消失，而35 ℃脫氫酶活性下降比較緩慢，表明在高溫老化進程中羅布麻種子脫氫酶活性下降速率明顯大于低溫老化的種子。50 ℃老化條件對羅布麻種子活性影響較大。

植物遭受滲透脅迫時，細(xì)胞中生物活性氧的積累是造成細(xì)胞傷害乃至死亡的主要原因，而細(xì)胞中清除活性氧的保護酶系統(tǒng)的存在和活性增強，是細(xì)胞免于傷害或抗性增強的主要原因之一[34]。過氧化物酶是細(xì)胞內(nèi)活性氧清除劑之一，和超氧化物歧化酶、過氧化氫酶統(tǒng)稱為細(xì)胞保護酶。一般認(rèn)為人工老化會影響細(xì)胞酶活性的變化，進而影響種子內(nèi)部的代謝過程，酶活性降低，清除過氧化物和自由基的能力逐漸降低，細(xì)胞損害加大[35]。通常情況下過氧化物酶活性會隨著老化的進行逐漸減低，對酶分子結(jié)構(gòu)的破壞隨老化時間的延長逐漸加劇。在本研究中種子過氧化物酶在不同的老化溫度下初期都有下降趨勢，這對于有毒物質(zhì)活性氧、自由基等的清除非常不利。本研究結(jié)果顯示在高溫高濕下過氧化物酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于低溫高濕老化環(huán)境下的活性，且在高溫(50 ℃)老化處理12 h后有微升趨勢。這可能是種子長時間處于高溫環(huán)境中為抵御50 ℃高溫的傷害，通過提高自身過氧化物酶的活性來降低傷害，這是對高溫老化作出主動適應(yīng)。說明羅布麻種子耐熱較強，能夠?qū)Ω邷丨h(huán)境作出抗逆反應(yīng)，羅布麻抵抗高溫及老化的能力強。

糖是植物組織含量最多的有機化合物，是生命活動的主要能量來源和細(xì)胞的重要物質(zhì)，可溶性糖是種子萌發(fā)至開始進行光合作用前的呼吸底物。細(xì)胞內(nèi)糖分的損失會對細(xì)胞正常的生理生化活動造成影響[30]。Kalpana和Madhava[36]在木豆(Cajanuscajan)栽培品種種子加速老化過程中脂類的變化中發(fā)現(xiàn)，隨種子劣變的發(fā)生，引起膜結(jié)構(gòu)損傷，造成滲出液的可溶性糖含量增加。朱世東和黎世昌[37]指出,老化洋蔥(A.cepa)種子浸出液電導(dǎo)率增加的同時，浸出液可溶性糖也有所增加。本研究結(jié)果表明，隨著老化的進行可溶性糖含量逐漸增大，在老化初期與正常種子相比變化不大，認(rèn)為可能是由于在老化初期種子經(jīng)過短暫自我修復(fù)，膜的傷害程度相對較小，可溶性糖作為電導(dǎo)率浸出液的成分之一，影響較小。在處理后起，質(zhì)膜的透性增大，種子受傷害的程度增加，可溶性糖量損失增加。本研究中證實電導(dǎo)率的變化受浸出液可溶性糖含量變化的影響。

4 結(jié)論

種子浸出液隨著老化程度的加大逐漸升高，且溫度越高增加越快，對膜的損傷程度越大，老化影響了羅布麻種子的膜系統(tǒng)，增加了細(xì)胞膜的滲透性，造成可溶性糖的滲漏。電導(dǎo)率的變化和浸出液糖含量有著直接的關(guān)系，電導(dǎo)率和可溶性含糖量的大小能反映出羅布麻細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性程度，可以作為快速測定羅布麻種子老化生理指標(biāo)。

人工老化過程中脫氫酶活性降低，脫氫酶不耐高溫在50 ℃條件下短時間內(nèi)活性完全喪失，對老化反應(yīng)比較敏感，溫度越高對脫氫酶活性影響越大。POD活性在50 ℃老化條件下大于35 ℃，說明羅布麻種子能夠?qū)Ω邷乩匣h(huán)境作出抗逆反應(yīng)，種子抗熱性較強。

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