王鳴剛，羅茂春，彭軼楠，盧 真，陳 亮

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；2.龍巖學(xué)院生物系，福建 龍巖 364012；3.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361005)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引起的烈性傳染病，主要感染偶蹄目動(dòng)物，患病動(dòng)物在消化道的皮狀粘膜、口、舌、唇、蹄間隙和蹄冠緣、乳房及皮膚的其他無毛發(fā)處等部位發(fā)生水泡和潰爛。人和非偶蹄動(dòng)物也可感染此病，但癥狀較輕。由于豬、牛、羊等主要的家畜均可感染此病，并能形成大規(guī)模地流行，所以國(guó)際獸疫局將該病列為A 類家畜傳染病之首[1]。

1989年美國(guó)科學(xué)家在煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)等植物上成功地制造了乙肝疫苗、大腸埃希菌疫苗，用這些植物喂飼小鼠后，均產(chǎn)生了預(yù)防接種的效果,引起了植物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方面專家的極大興趣和關(guān)注[2]。自第1例轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗出現(xiàn)以來,很多植物疫苗已問世,并在動(dòng)物和人體內(nèi)進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。結(jié)果表明,植物疫苗在預(yù)防感染性疾病、治療腫瘤和自身免疫病等方面是可行有效的[3]。

轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗，以其獨(dú)特的優(yōu)越性迅猛發(fā)展，其研究和應(yīng)用開辟了植物生物技術(shù)的新天地。轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗將成為生物制藥的重要發(fā)展方向[4-6]。

口蹄疫病原為口蹄疫病毒，屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，是目前所知病毒中最細(xì)微的一級(jí)，具有7種不同的血清型。7 種不同血清型可根據(jù)核酸同源性大小分為兩群：O、A、C 和Asia I 為第1群，SAT1、SAT2、SAT3 為第2群。群內(nèi)各型同源性達(dá)60%～70%，但兩群之間同源性僅為25%～40%，各血清型間無血清交叉和交叉免疫現(xiàn)象，各個(gè)血清型又包括多個(gè)亞型[7]。O型口蹄疫為全世界流行最廣的一個(gè)血清型，我國(guó)流行的口蹄疫主要為O、A、C三型及ZB型[7]。

本試驗(yàn)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將口蹄疫抗原決定簇融合基因O21-O14-A21-HBcAg轉(zhuǎn)入苜蓿(Medicagosativa)品種甘農(nóng)1號(hào)中，希望獲得轉(zhuǎn)基因植株。從中選出高表達(dá)口蹄疫抗原決定簇融合基因的植株，期望通過免疫動(dòng)物獲得對(duì)口蹄疫病毒的免疫應(yīng)答。

1 材料與方法

1.1材料 甘農(nóng)1號(hào)苜蓿品種由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。農(nóng)桿菌株EHA105由蘭州理工大學(xué)植物細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。pCAMBIA1301 雙元載體，含T-DNA左右邊界序列、植物抗性篩選標(biāo)記HPT、抗性標(biāo)記NPT-Ⅱ、報(bào)告基因GUS以及多克隆位點(diǎn)(MCS)，由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室提供。O型和A型口蹄疫抗原決定簇融合基因(O21-O14-A21-HBcAg)植物表達(dá)載體(pCAMBIA1301-O21-O14-A21-HBcAg)由蘭州理工大學(xué)植物細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 融合基因O21-O14-A21-HBcAg植物表達(dá)載體結(jié)構(gòu)

植物誘導(dǎo)(繼代)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)基(B5H)：B5+2,4-D 0.1 mg/L+KT(Kinetin)0.1 mg/L；篩選培養(yǎng)基(B5HHT1)：B5+2,4-D 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L+Hyg(潮要素)1 mg/L+Timentin 300 mg/L；誘導(dǎo)胚性愈傷組織培養(yǎng)基(B5HHT2)：B5+2,4-D 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L+Hyg 1 mg/L+Timentin 200 mg/L；分化培養(yǎng)基(B5HT)：B5+Hyg 1 mg/L+Timentin 100 mg/L；誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基(1/2MSHT)：1/2MS(蔗糖10 g/L)+Hyg 1 mg/L+Timentin 100 mg/L。

1.2方法

1.2.1苜蓿再生系統(tǒng)的建立 取出芽?jī)芍艿膶?shí)生苗葉片作為外植體，平鋪至B5H培養(yǎng)基中。繼代一次后將愈傷組織轉(zhuǎn)至B5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體胚的分化，兩周繼代一次，在淡黃色(或黃綠色)愈傷組織上長(zhǎng)出綠點(diǎn)。待胚狀體長(zhǎng)成魚雷狀且可清晰地辨認(rèn)單個(gè)胚狀體時(shí)，將其單個(gè)分離并轉(zhuǎn)至新的B5培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。待胚狀體發(fā)育成小苗并有少數(shù)根后，將小苗移植到1/2 MS生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，移植20 d后統(tǒng)計(jì)根生長(zhǎng)情況。

1.2.2苜蓿愈傷組織對(duì)潮霉素的基礎(chǔ)抗性測(cè)定 將苜蓿的愈傷組織放置于含不同潮霉素(Hygromycin，Hyg)質(zhì)量濃度的B5H培養(yǎng)基上，觀察其生長(zhǎng)狀況20 d，進(jìn)而確定最佳潮霉素抗性篩選質(zhì)量濃度。

1.2.3轉(zhuǎn)化、篩選和潮霉素抗性植株的再生 取新鮮苜蓿葉片，在B5H中預(yù)培養(yǎng) 4 d，待農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600約0.6時(shí)，取1 mL菌液加到9 mL MS液體培養(yǎng)基中混勻；將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的葉片加入到上述混合液中，放置20 min。取出侵染后的葉片組織，置于B5H培養(yǎng)基中，暗處共培養(yǎng)4～5 d后取出葉片，轉(zhuǎn)移到B5HHT1培養(yǎng)基中篩選。將篩選20 d后的葉片組織轉(zhuǎn)至B5HHT2培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，并在B5HT中誘導(dǎo)分化；分化培養(yǎng)基中分化出小苗后將再生苗移植到1/2 MSHT中誘導(dǎo)生根。然后，移植到營(yíng)養(yǎng)缽中繼續(xù)生長(zhǎng)。

1.2.4組織化學(xué)及分子生物學(xué)方法檢測(cè) GUS基因(與口蹄疫基因構(gòu)建在一起的轉(zhuǎn)入基因)活性的組織化學(xué)染色檢測(cè)，參照王關(guān)林和方宏筠[8]的方法。

PCR檢測(cè)與分析：融合基因O21-O14-A21-HBcAg全長(zhǎng)900 bp。通過Primer Premier 5軟件對(duì)融合基因內(nèi)部序列設(shè)計(jì)引物，兩條引物之間約540 bp。

5′端引物：5′-TGCCTTCTGACTTCTTTCC-3′；3′端引物：5′-CCTGCCTCGTCGTCTAAC-3′。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性45 s，52 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1甘農(nóng)1號(hào)愈傷組織形成及分化情況 甘農(nóng)1號(hào)葉片外植體接種于B5H培養(yǎng)基中，于25 ℃、14 h/d光照條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷，20 d后取其中7個(gè)重復(fù)組統(tǒng)計(jì)愈傷數(shù)，出愈率為95.2%。有65個(gè)外植體分化出了綠點(diǎn)，分化率達(dá)61.9%，分化時(shí)間(即愈傷組織上形成第1個(gè)綠點(diǎn)所需的時(shí)間)為25～35 d。

2.2潮霉素的質(zhì)量濃度對(duì)苜蓿葉片愈傷組織形成的影響 結(jié)果表明，在0.5 mg/L的選擇壓下，抗性愈傷組織形成情況與對(duì)照組無明顯差異。隨著潮霉素質(zhì)量濃度的提高，愈傷組織逐漸變黃，長(zhǎng)勢(shì)明顯減弱。當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí)，20 d后葉片單個(gè)外植體部分褐化死亡，部分正常長(zhǎng)出愈傷組織，長(zhǎng)出的愈傷組織相對(duì)于對(duì)照組稍小且黃；當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度加到2 mg/L時(shí)，20 d后葉片基本枯黃，多數(shù)不能正常形成愈傷組織(表1)。因此，可確定以甘農(nóng)1號(hào)葉片作為轉(zhuǎn)化材料，其愈傷誘導(dǎo)分化潮霉素的選擇壓力為1 mg/L。

表1 不同選擇壓力對(duì)苜蓿葉片愈傷組織形成的影響

2.3抗性愈傷組織的篩選及其再生植株的獲得 取出在B5H培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)4 d的葉片，將其同農(nóng)桿菌菌液混合侵染20 min，經(jīng)過在B5H培養(yǎng)基上5 d的共培養(yǎng)后，接種于B5HHT1培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。經(jīng)約10 d，葉片部分枯黃，某些區(qū)域開始突起形成抗性愈傷組織(圖2A)，20 d后愈傷組織基本覆蓋葉片。在B5HHT2培養(yǎng)基上繼代一次后轉(zhuǎn)至B5HT培養(yǎng)基上，約兩周后抗性愈傷長(zhǎng)出綠色的芽點(diǎn)(圖2B)，并很快的分化成芽。將芽分離置于新的B5HT培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過25～30 d芽逐漸長(zhǎng)出葉片，并在基部分化出根(圖2C)。最終形成植株52株，出芽率49.5%，其中生根的植株有48株，生根率達(dá)到45.7%(圖2D)。

2.4組織化學(xué)及分子生物學(xué)方法檢測(cè)

2.4.1GUS基因在轉(zhuǎn)化后的愈傷組織中的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè) 轉(zhuǎn)化愈傷(葉片)組織在培養(yǎng)30 d后，取抗性愈傷組織進(jìn)行GUS基因組織化學(xué)染色檢測(cè)，轉(zhuǎn)化愈傷組織塊表面部分呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)(圖3)。

圖2 轉(zhuǎn)基因苜蓿再生過程

圖3 GUS基因在轉(zhuǎn)化愈傷中的瞬時(shí)表達(dá)(右邊為陰性對(duì)照)

2.4.2PCR檢測(cè)結(jié)果 以抗性植株葉片分別提取的基因組總DNA為模板，用前面所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖4)，結(jié)果表明，抗性植株擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為540 bp條帶，與陽(yáng)性對(duì)照一致，而陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)化植株)未擴(kuò)增出任何條帶。表明目的基因O21-O14-A21-HBcAg已整合到轉(zhuǎn)化植株的染色體基因組中。在隨即檢測(cè)的7株農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化再生植株中，有4株呈陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性率為57.1%。

圖4 轉(zhuǎn)基因抗性植株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

3.1基因型對(duì)愈傷組織的形成與分化的影響 愈傷組織的形成受到外植體供體的基因型、培養(yǎng)基成分、外界環(huán)境等諸多因素的影響，是個(gè)復(fù)雜的過程。然而，在苜蓿的組織培養(yǎng)中，王鳴剛等[9]先前的研究結(jié)果表明苜蓿葉片形成愈傷組織的能力同基因型關(guān)系并不大。在本研究中，曾嘗試對(duì)隴東等其他品種進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)隴東苜蓿在B5H培養(yǎng)基中極不容易形成愈傷，與前人的研究結(jié)果[10-11]有不相符之處。

苜蓿愈傷組織的形成大致可分為誘導(dǎo)、細(xì)胞分裂和細(xì)胞分化3個(gè)過程。本研究發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的長(zhǎng)勢(shì)與分化能力并無必然關(guān)聯(lián)。愈傷組織有可能單極瘋長(zhǎng)，卻并不分化。也有愈傷組織表面分化的綠點(diǎn)不斷地細(xì)胞分裂，但沒有進(jìn)一步分化成莖葉等結(jié)構(gòu)。而一些葉片，特別是經(jīng)過潮霉素篩選的葉片，初期會(huì)枯萎，在20多天后才開始形成愈傷組織并進(jìn)一步分化出胚體。在分化能力方面，各個(gè)基因型間存在顯著差異(結(jié)果未列出)，甘農(nóng)1號(hào)是最適合的再生體系的品種。

3.2潮霉素對(duì)抗性再生的抑制 確定選擇壓力的要求是：選擇性抗生素的濃度既能有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，使之慢慢死亡，又不能對(duì)受體植物細(xì)胞有嚴(yán)重的毒性，影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長(zhǎng)分化。多數(shù)研究者采用一步法，即在整個(gè)愈傷誘導(dǎo)、分化及生根過程中采用相同的篩選壓，篩選壓多選擇半致死濃度，降低抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的損害，但是篩選效率較低。多步篩選法是在外植體最初誘導(dǎo)形成愈傷的幾周采用較低的篩選壓，等愈傷長(zhǎng)到一定程度后，提高抗生素的濃度[12]。也有人采用篩選壓濃度先高后低的方法[13],多步法篩選得到的再生苗陽(yáng)性率較高，但采用先低后高的篩選壓容易產(chǎn)生嵌合體，先高后低則由于開始篩選壓過高，多數(shù)細(xì)胞無法正常生長(zhǎng)、分化而降低再生率。轉(zhuǎn)基因苜蓿研究中通常采用Austin等[14]建立的一步法，本試驗(yàn)在愈傷形成、分化及生根過程中均使用1 mg/L的潮霉素作為篩選壓，初步結(jié)果表明陽(yáng)性率接近50%，篩選效率較高。但在該質(zhì)量濃度下，再生苗生根明顯受到抑制，根生長(zhǎng)緩慢且很少有根毛的分化，這可能是由于根組織相對(duì)于葉片對(duì)潮霉素敏感性更高。

3.3預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 預(yù)培養(yǎng)可促進(jìn)細(xì)胞分裂，分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源DNA，從而提高外源基因的短暫表達(dá)和穩(wěn)定整合率。陳晨等[15]對(duì)預(yù)培養(yǎng)影響苜蓿的轉(zhuǎn)化效率的研究表明，預(yù)培養(yǎng)5 d抗性愈傷的形成率及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率都最高。本試驗(yàn)在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化前，對(duì)葉片進(jìn)行4～5 d的預(yù)培養(yǎng)。

農(nóng)桿菌侵染外植體時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。在侵染過程中，一方面要使農(nóng)桿菌充分接觸葉片，另一方面又要將細(xì)菌對(duì)植物組織的傷害降低到最小。陳晨等[15]的研究表明，苜蓿葉片侵染20 min時(shí)瞬時(shí)表達(dá)率及抗性愈傷形成率最高。參考不同學(xué)者的研究方法，本試驗(yàn)選擇農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為20 min。

農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)在整個(gè)轉(zhuǎn)化過程中是非常重要的環(huán)節(jié)，T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在這一時(shí)期內(nèi)完成。農(nóng)桿菌附著后不能立即轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存16 h后的菌株才能誘發(fā)腫瘤，這一段時(shí)間被稱為“細(xì)胞調(diào)節(jié)期”[16-17]。因此，共培養(yǎng)的時(shí)間必須大于16 h，時(shí)間太短不能實(shí)現(xiàn)T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合。但如果共培養(yǎng)的時(shí)間太長(zhǎng)，農(nóng)桿菌過度增殖會(huì)使外植體受到毒害甚至死亡，同時(shí)后續(xù)試驗(yàn)中農(nóng)桿菌也不易被清除。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一般共培養(yǎng)4 d的農(nóng)桿菌就開始大量生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)不利于后面葉片的抑菌培養(yǎng)和分化。因此，本試驗(yàn)采用共培養(yǎng)3～5 d后除去葉片表面的農(nóng)桿菌，置于含Timentin的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷的形成。

3.4抗性苗再生過程中的植株異型現(xiàn)象 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從愈傷組織分化出的胚體細(xì)胞可進(jìn)一步分化形成葉片狀結(jié)構(gòu)，但該“葉片”較正常植株的葉片更加粗厚，且體積相對(duì)較大。這些異化的結(jié)構(gòu)在經(jīng)過一段時(shí)間后有些可以在原有結(jié)構(gòu)上重新長(zhǎng)出正常的植株，但是植株與未被農(nóng)桿菌侵染的正常再生苗相比顯得纖弱。這種情況下，要形成正常的植株往往要經(jīng)歷更加漫長(zhǎng)的時(shí)間。因此，本試驗(yàn)對(duì)這些材料提供的培養(yǎng)基漸次降低潮霉素和抗生素的濃度，以縮短出苗時(shí)間。

3.5轉(zhuǎn)單一抗原與融合抗原基因植物的比較 Dimarchi等[18]用合成FMDV VP1 141～158和200～213片段氨基酸組成的40個(gè)氨基酸肽(半胱氨酸-半胱氨酸-200～213-脯氨酸-脯氨酸-絲氨酸-141～158-脯氨酸-半胱氨酸-甘氨酸)，在其中間加上兩個(gè)脯氨酸和一個(gè)絲氨酸，使多肽折成立體構(gòu)型，大大提高了單段肽(141～158-脯氨酸-半胱氨酸-甘氨酸)在豚鼠中的應(yīng)答水平，并提出了N-末端氨基酸(半胱氨酸-半胱氨酸)在提高保護(hù)應(yīng)答中的重要性。Brown[19]用化學(xué)法合成了FMDV VP1基因編碼的140～160及200～213位肽段的基因片段，并在大腸桿菌體內(nèi)得到了表達(dá)，用其免疫牛、豬等都獲得了較好的免疫力。Doel 等[20]根據(jù)FMDV A、O、C三型的VP1序列分別合成了含各型病毒VP1蛋白的141～158和200～213片段氨基酸殘基的多肽。分別將各多肽與油佐劑混合接種牛和豚鼠上，誘導(dǎo)產(chǎn)生了高水平的抗同型病毒和抗接種肽的抗體，并且針對(duì)A型和O型FMDV合成的多肽接種的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能抵抗同型病毒的攻擊，但C型效果較差。由于我國(guó)流行的口蹄疫主要為O、A、C三型及ZB型[7]，綜合前人試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)構(gòu)建O型和A型口蹄疫特異抗原決定簇融合基因(O21-O14-A21-HBcAg)植物表達(dá)載體，并以此轉(zhuǎn)化苜蓿，期望表達(dá)特異抗原，進(jìn)行特異保護(hù)。

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