張紅玉，楊 斌，何月秋

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550001; 2.西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明650224; 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明650201)

植物為了有效地保護(hù)自身免受病蟲害的侵害而經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化產(chǎn)生了一系列化學(xué)防御物質(zhì)。其中，當(dāng)植物遭受病原菌侵染、昆蟲取食、化學(xué)因子、機(jī)械損傷時(shí)均能造成某些揮發(fā)性組分(volatile organic compounds,VOCs)的大量釋放[1-3]。在各類揮發(fā)性組分當(dāng)中，不少組分具有抑菌抑蟲活性，可能充當(dāng)了直接阻止、抵御病原菌侵染或昆蟲取食的化學(xué)防衛(wèi)因素；有的組分是植物防衛(wèi)基因表達(dá)的高效調(diào)節(jié)子；還有的組分是植物自身或植物間傳遞信息的化學(xué)信號(hào)分子，例如植物報(bào)警信號(hào)(warning signal)、引誘捕食性或寄生性天敵信號(hào)(guiding signal)[4]。作為植物次生代謝產(chǎn)物，這些揮發(fā)物在提高植物自身保護(hù)和生存競(jìng)爭(zhēng)能力、協(xié)調(diào)與環(huán)境的關(guān)系中充當(dāng)著重要的角色[5]，對(duì)植物的化學(xué)防御起到重要的作用并具有重要的生態(tài)學(xué)意義[6-7]。

隨著研究的深入，人們對(duì)揮發(fā)物產(chǎn)生、釋放及其在植物化學(xué)防御中的作用機(jī)制已有越來(lái)越多的認(rèn)識(shí)，尤其對(duì)于蟲害誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物揮發(fā)性化合物(herbivore-induced plant volatiles，HIPVs)的代謝調(diào)控機(jī)制已進(jìn)行了大量研究[8]，但對(duì)于病原菌毒素脅迫下植物揮發(fā)性組分的研究還比較少。紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)揮發(fā)性化合物本身具有抑菌活性[9]，但松針褐斑病菌(Lecanostictaacicola)毒素脅迫對(duì)于紫莖澤蘭揮發(fā)性組分及其化學(xué)防御有何影響尚不清楚。本研究測(cè)定該毒素脅迫對(duì)紫莖澤蘭揮發(fā)性組分的影響，探討毒素脅迫對(duì)紫莖澤蘭化學(xué)防御可能存在的影響，以期為進(jìn)一步闡明松針褐斑病菌毒素對(duì)紫莖澤蘭的傷害機(jī)理和惡草抗性問(wèn)題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試雜草：紫莖澤蘭采自西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。

供試病原真菌：松針褐斑病菌由福建沙縣官莊林場(chǎng)嚴(yán)重感病的濕地松(Pinuselliottii)松針上分離得到。經(jīng)分離、純化，菌種保存于西南林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

試驗(yàn)儀器：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GS-MS，F(xiàn)INNIGAN TOP 8000/VOYAGER)、水蒸氣蒸餾提取器。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1供試松針褐斑病菌毒素粗提溶液的制備 參照楊斌等[10]的方法，具體步驟如下：

1)病原真菌產(chǎn)毒培養(yǎng)：挑取經(jīng)PDA擴(kuò)繁10 d后的菌絲，接種于已滅菌并裝有 250 mL PD培養(yǎng)液的三角瓶中(每個(gè)三角瓶接種菌絲塊大小基本一致)，置于搖床上，轉(zhuǎn)速120 r/min，25 ℃下振蕩培養(yǎng)25 d。用墊有雙層濾紙的布氏漏斗真空抽濾培養(yǎng)物，濾去菌絲即得毒素原液。

2)毒素粗提溶液制備：取毒素原液100 mL，置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)，60 ℃下抽真空旋轉(zhuǎn)將水分蒸干。然后，分3次共加入300 mL氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿∶甲醇=2∶3)，40 ℃下振蕩提取30 min,重復(fù)3次以便提取充分。合并3次提取液，在40 ℃下經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸去有機(jī)溶劑，蒸干后得毒素粗提物，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。用無(wú)菌水將毒素粗提物配制成2.5 mg/mL的溶液，作為供試毒素粗提液。

1.2.2供試雜草材料的初處理 自無(wú)病蟲害的紫莖澤蘭植株摘取生長(zhǎng)均勻一致的葉片，先用自來(lái)水沖洗，再用濾紙吸干水分，混合均勻，待用。從以上葉片中，稱取130 g紫莖澤蘭新鮮葉片(樣品A)；再稱取130 g，置于2.5 mg/mL毒素粗提液中，浸泡48 h后，濾去毒素粗提液，葉片用蒸餾水沖洗干凈，為毒素脅迫紫莖澤蘭離體葉片(樣品B)。取一定量的紫莖澤蘭植株，插于2.5 mg/mL毒素粗提液中，48 h后，采下葉片，稱取130 g，為毒素脅迫紫莖澤蘭植株的離體葉片(樣品C)。

1.2.3揮發(fā)油的提取 采用蒸餾萃取法分別對(duì)3種不同處理的葉片材料進(jìn)行揮發(fā)油的提取，萃取溶劑為石油醚。把材料放入蒸餾萃取裝置一端的500 mL圓底燒瓶中，用電熱套加熱；裝置的另一端為盛有25 mL石油醚的100 mL圓底燒瓶，在60 ℃下水浴加熱[11]。同時(shí)蒸餾萃取4 h，再蒸去石油醚，得到具有濃烈香味的淺黃色揮發(fā)油，樣品A、B和C的收油率分別為0.20%、0.89%和0.19%。

1.2.4揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)譜分析 GC-MS分析測(cè)試條件為，色譜柱HP-5MS(60 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣He；流速1 mL/min；進(jìn)樣溫度240 ℃；接口溫度250 ℃；質(zhì)譜掃描范圍為35～455 amu；離子源EI源；電子能量70 eV。

2 結(jié)果與分析

3種不同處理方法得到的揮發(fā)性成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)譜分析總離子流圖分別見(jiàn)圖1(186個(gè)峰)、圖2(259個(gè)峰)、圖3(232個(gè)峰)。以相似度>80，相對(duì)含量>0.1%為數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)，排除一些可信度不高、含量極少的物質(zhì)。

2.1不同樣品所產(chǎn)生揮發(fā)物的組分差異 經(jīng)數(shù)據(jù)處理，樣品A、B、C產(chǎn)生的揮發(fā)物組分?jǐn)?shù)分別為39、60、53個(gè)，樣品B為樣品A組分?jǐn)?shù)的近1.54倍，樣品C為樣品A組分?jǐn)?shù)的近1.36倍，說(shuō)明松針褐斑病菌毒素脅迫可誘導(dǎo)紫莖澤蘭離體葉片產(chǎn)生更多的揮發(fā)物組分。其中，受毒素脅迫紫莖澤蘭離體葉片較受毒素脅迫紫莖澤蘭植株的離體葉片產(chǎn)生的揮發(fā)物組分?jǐn)?shù)更多。

樣品A、B、C產(chǎn)生的揮發(fā)物當(dāng)中，相對(duì)含量大于2%的主要組分各有6個(gè)、11個(gè)、9個(gè)。以樣品B所產(chǎn)生揮發(fā)物的主要組分最多，其次為樣品C，樣品A相對(duì)最少。結(jié)果表明，與新鮮離體葉片相比，受毒素脅迫后，紫莖澤蘭離體葉片不僅產(chǎn)生了更多種揮發(fā)物組分，而且相對(duì)含量超過(guò)2%的主要組分的個(gè)數(shù)也增至新鮮葉片的1.83倍和1.50倍。

不同樣品所產(chǎn)生的揮發(fā)物主要組分及其含量明顯不同(表1)，僅α-紅沒(méi)藥醇(α-Bisabolol)是不同樣品中唯一共有的主要組分，但在不同樣品中的含量有差異。α-紅沒(méi)藥醇在樣品A、B、C所產(chǎn)生揮發(fā)物當(dāng)中的相對(duì)含量分別為7.19%、4.60%、5.08%，表明新鮮葉片中的α-紅沒(méi)藥醇明顯高于該揮發(fā)物在受毒素脅迫離體葉片和受毒素脅迫植株的離體葉片當(dāng)中的相對(duì)含量，由此顯示出受毒素脅迫后，紫莖澤蘭離體葉片所產(chǎn)生的α-紅沒(méi)藥醇相對(duì)含量較新鮮葉片有不同程度的減少。另外，在樣品A和樣品B中，α-紅沒(méi)藥醇是相對(duì)含量最高的組分；在樣品C中，它的相對(duì)含量?jī)H略次于乙酸冰片酯。前人研究[12]表明，α-紅沒(méi)藥醇具有廣譜抗菌作用，也是雞血藤(Caulisspatholobi)等多種植物的揮發(fā)物當(dāng)中相對(duì)含量較高的組分。乙酸冰片酯是樣品B和樣品C共有的揮發(fā)物主要組分，且相對(duì)含量均超過(guò)4%，但該組分不存在于樣品A當(dāng)中，是受毒素脅迫后才產(chǎn)生的主要組分。

受脅迫離體葉片和受脅迫植株離體葉片產(chǎn)生的揮發(fā)物的組分及其相對(duì)含量存在差異，這可能與受毒素脅迫的部位不同有關(guān)，進(jìn)一步的可能性原因是：紫莖澤蘭不同部位在受到毒素脅迫后產(chǎn)生揮發(fā)物的時(shí)間、途徑各不相同，最終造成揮發(fā)物的組分及其相對(duì)含量因受脅迫部位不同而出現(xiàn)差異。

以往的研究[13-14]表明，不同真菌毒素的除草活性、作用位點(diǎn)、作用機(jī)制、致病機(jī)理各不相同，結(jié)合本研究結(jié)果，可以推斷：毒素脅迫雜草的方式不同或者部位不同，直接影響到雜草合成組分各異、相對(duì)含量不同的揮發(fā)物。因此，如果進(jìn)一步研究毒素脅迫對(duì)雜草化學(xué)防御的作用機(jī)制或調(diào)控機(jī)制，很可能有助于為人們尋求新的雜草除控策略提供新思路。

圖1 新鮮葉片內(nèi)揮發(fā)物GC-MS分析總離子流

圖2 毒素脅迫離體葉片內(nèi)揮發(fā)油GC-MS分析總離子流

圖3 毒素脅迫植株葉片內(nèi)揮發(fā)油GC-MS分析總離子流

2.2不同樣品所產(chǎn)生脂肪類、芳香類和萜類揮發(fā)物的差異 經(jīng)GC-MS測(cè)試分析，紫莖澤蘭揮發(fā)性化合物的基本化學(xué)組成為脂肪族化合物、萜類化合物和芳香族化合物(表2)。這幾類植物揮發(fā)性物質(zhì)大多具有抑菌、殺菌或殺蟲活性[15-20]，或者可以作為植物抵御病原菌侵染的防衛(wèi)因子及信號(hào)分子[7]。

與樣品A相比，受毒素脅迫后，不論是樣品B，還是樣品C，脂肪族類和萜類組分?jǐn)?shù)均增加，萜類組分的增加尤其明顯，與此相反，芳香族類組分減少(表2)。

芳香族化合物(含有苯環(huán))屬于碳環(huán)化合物(含有完全由碳原子組成的環(huán))；萜類化合物是具有(C5H8)n通式以及其含氧和不同飽和程度的衍生物，可以看成是由異戊二烯或異戊烷以各種方式連結(jié)而成的一類天然化合物；脂肪族化合物，又稱為直鏈化合物，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是碳與碳間連接成不閉口的鏈。從某種意義上說(shuō)，毒素脅迫后揮發(fā)性化合物雙鍵比例減少，是還原反應(yīng)的結(jié)果，揮發(fā)性成分大量被還原，顯示有另外的物質(zhì)發(fā)生了氧化反應(yīng)。

表1 不同樣品中揮發(fā)物的主要組分及其相對(duì)含量

表2 不同樣品中各類揮發(fā)物的數(shù)量差異

3 討論

前人研究[21-22]表明，由松針褐斑病菌產(chǎn)生的毒素不僅是寄主松科植物的致病毒素，而且屬于非寄主專化性毒素，能使空心蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)、稗草(Echinochloacrusgalli)表現(xiàn)出明顯的傷害癥狀，生長(zhǎng)受到抑制。此外，該毒素對(duì)外來(lái)入侵雜草紫莖澤蘭的脅迫研究表明，毒素脅迫能引起紫莖澤蘭過(guò)氧化氫酶(catalase)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)等6種抗病相關(guān)酶活性發(fā)生變化[23]，能誘發(fā)紫莖澤蘭葉片電解質(zhì)滲漏[24]，誘發(fā)鈣和鉀等礦質(zhì)元素滲漏[25]，從而影響紫莖澤蘭對(duì)病蟲害的化學(xué)防御能力。

已有文獻(xiàn)報(bào)道[26-28]，紫莖澤蘭具有化感作用，本研究通過(guò)對(duì)松針褐斑病菌毒素脅迫下紫莖澤蘭葉片氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的分析證實(shí)了這一點(diǎn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，毒素作用后紫莖澤蘭揮發(fā)物的成分明顯增多，其中脂肪族類和萜類化合物數(shù)量增多，而芳香族化合物數(shù)量減少，這不僅說(shuō)明松針褐斑病菌毒素脅迫可誘導(dǎo)紫莖澤蘭產(chǎn)生更多的具有抗病蟲活性的揮發(fā)性化合物，而且還預(yù)示著遭受毒素脅迫后，紫莖澤蘭葉片內(nèi)出現(xiàn)了劇烈的生理生化反應(yīng)。過(guò)去，從酶的角度證實(shí)過(guò)毒素脅迫能引起植物發(fā)生異常的生理生化反應(yīng)，本研究從小分子代謝產(chǎn)物角度也證實(shí)這種異常反應(yīng)的存在，化合物差異的巨大還說(shuō)明，毒素影響的可能不止是某個(gè)反應(yīng)鏈，而是整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)。

從某種意義上說(shuō)，松針褐斑病菌毒素脅迫后紫莖澤蘭揮發(fā)物雙鍵比例減少，這也從終產(chǎn)物的角度闡明該毒素誘發(fā)紫莖澤蘭氧化反應(yīng)，與過(guò)去認(rèn)為毒素作用后植物活性氧含量增加的結(jié)論一致。病原菌侵入植物后可誘導(dǎo)活性氧的爆發(fā)，并且，活性氧在病原菌與植物的非寄主互作中較之在寄主互作中的積累更明顯，活性氧的爆發(fā)已被認(rèn)為是寄主防衛(wèi)反應(yīng)之一[26]。某些活性氧可以充當(dāng)信號(hào)分子，在植物遭受病原菌的初始侵染后傳遞信號(hào)，從而使植物組織產(chǎn)生一系列的抗病防御反應(yīng)[27-28]。當(dāng)然，植物體內(nèi)包括酶在內(nèi)的很多物質(zhì)對(duì)活性氧迸發(fā)都有重要影響[29]，即便不同的溫度條件對(duì)活性氧代謝的影響也有所差異[30]。盡管毒素脅迫后紫莖澤蘭體內(nèi)活性氧代謝變化的真實(shí)情況尚待測(cè)定，而且活性氧迸發(fā)可能是多種活性氧總體的反應(yīng)結(jié)果，但本研究至少?gòu)牧硪粋€(gè)側(cè)面說(shuō)明松針褐斑病菌毒素脅迫不僅關(guān)系到對(duì)紫莖澤蘭抗性的影響，而且還關(guān)系到在紫莖澤蘭與病蟲害互作過(guò)程中起作用的其他因子或環(huán)節(jié)。

作為植物重要的化學(xué)防御途徑，揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物在保護(hù)植物免遭病原菌、昆蟲的侵染中發(fā)揮了重要作用。植物揮發(fā)性化合物的組成和含量受到植物不同基因型和化學(xué)型、不同發(fā)育時(shí)期，以及不同環(huán)境因子的影響[31-32]，這些差異與植物化學(xué)防御的關(guān)聯(lián)值得進(jìn)一步研究。另外，植物揮發(fā)性物質(zhì)是多種復(fù)雜組分的混合物，植物抵御病原菌和植食性昆蟲的策略亦是多組分協(xié)同作用的結(jié)果。因此，開(kāi)展外來(lái)入侵雜草揮發(fā)性化合物的合成途徑、調(diào)控機(jī)制、影響因素等方面的研究，進(jìn)一步闡明揮發(fā)物在雜草化學(xué)防御反應(yīng)中的作用，對(duì)研究和尋找除控雜草的有效途徑具有指導(dǎo)意義。

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