陳冬梅，楊宇虹，晉 艷，王海斌，段玉琪，尤垂淮，田衛(wèi)霞，林瑞余，林文雄

(1.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建 福州 350002；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 653100)

連作障礙(Successive cropping obstacles)是指在同一塊土壤中連續(xù)栽培同種或同科的作物時(shí)，即使在正常的栽培管理狀況下，也會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酢a(chǎn)量降低、品質(zhì)下降、病蟲害嚴(yán)重的現(xiàn)象[1]。煙草(Nicotianatabacum)是我國(guó)最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，也是忌連作的作物，煙草長(zhǎng)期連作極易造成病蟲害增多，產(chǎn)量、品質(zhì)下降，連作障礙是煙草生產(chǎn)中亟待解決的問題。

目前，作物連作障礙的成因可歸納為3個(gè)方面，即土壤理化性狀變劣、化感自毒作用和土壤微生物區(qū)系的變化[2-4]。據(jù)報(bào)道，作物連作障礙與根系分泌物中的化感物質(zhì)密切相關(guān)，例如，黃瓜(Cucumissativus)[5]、辣椒(Capsicumfrutescens)[6]、大豆(Glycinemax)[7]和地黃(Radixrehmanniae)等[8]植物的根系分泌物均具有自毒作用，這些自毒物質(zhì)可以通過影響細(xì)胞膜透性、酶活性、離子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白質(zhì)和DNA表達(dá)等多種途徑來影響植物生長(zhǎng)。陳冬梅[9]研究發(fā)現(xiàn)，自毒物質(zhì)是導(dǎo)致煙草連作障礙的關(guān)鍵因素之一，深入分析煙草連作土壤化學(xué)物質(zhì)成分，對(duì)揭示煙草連作障礙機(jī)理具有重要意義。然而土壤是一個(gè)復(fù)雜的體系，土壤化學(xué)成分復(fù)雜，土壤中自毒物質(zhì)成分難以分離與鑒定。因此，本研究以連作烤煙12年的土壤為材料，探討烤煙連作土壤與對(duì)照土壤自毒潛力及其主要化學(xué)物質(zhì)成分差異，為進(jìn)一步分離、鑒定煙草自毒物質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn) 田間試驗(yàn)于2008-2009年在云南煙草科學(xué)研究院玉溪試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)材料 供試烤煙品種為K326。煙田為連作烤煙12年的田地，以未種植過煙草的田地為對(duì)照。連作煙田的基本理化指標(biāo)為：土壤pH值7.96，有機(jī)質(zhì)含量2.03%，水解氮51.2 mg/kg，速效磷63.3 mg/kg，速效鉀164.8 mg/kg，全氮1.12 g/kg，全磷2.16 g/kg，全鉀12.8 g/kg，陽離子交換量57.7 mmol/kg；對(duì)照土壤的基本理化指標(biāo)為：土壤pH值7.89，有機(jī)質(zhì)含量1.98%，水解氮49.8 mg/kg，速效磷61.2 mg/kg，速效鉀167.3 mg/kg，全氮1.08 g/kg，全磷2.05 g/kg，全鉀11.5 g/kg，陽離子交換量56.8 mmol/kg。

采用四分法收集煙草根際土壤和對(duì)照土壤，用于土壤自毒潛力分析及化學(xué)物質(zhì)成分檢測(cè)。

1.3土壤自毒潛力分析 根際土壤化感自毒潛力評(píng)價(jià)采用土壤-瓊脂三明治法[10]進(jìn)行測(cè)定，并略做修改。稱取土壤樣品15 g，倒入30 mL冷卻至約45 ℃，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂溶液，充分混勻，待固化后再加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的瓊脂溶液覆蓋表面，冷卻后每個(gè)培養(yǎng)皿中播入10粒預(yù)萌發(fā)的萵苣(Lactucasativa)或煙草，設(shè)無土處理為對(duì)照，5次重復(fù)，置于人工氣候箱中。萵苣培養(yǎng)溫度為25 ℃，煙草培養(yǎng)溫度為30 ℃，每天光照12 h(07:00-19:00)。萵苣培養(yǎng)3 d后測(cè)定根長(zhǎng)，煙草根長(zhǎng)在培養(yǎng)10 d后測(cè)定。不同土壤的化感自毒潛力，即受體的相對(duì)抑制率(Inhibition rate，IR)計(jì)算公式為：

IR=(1-處理值/對(duì)照值)×100%。

1.4土壤浸提液制備及自毒潛力分析 將土壤風(fēng)干過2 mm篩，稱取1 000 g加入70%的乙醇2 L，超聲波浸提1 h，重復(fù)浸提3次，過濾并濃縮至200 mL，得到5 g/mL的浸提液(即1 mL水溶液中含5 g土壤提取物)。以5 g/mL的浸提液為母液，配制2 g/mL 浸提液，以相同質(zhì)量濃度的土壤浸提液為對(duì)照。每個(gè)培養(yǎng)皿中點(diǎn)播10粒預(yù)萌發(fā)的萵苣或煙草種子后，分別添加5 mL不同土壤浸提液或無菌水，萵苣培養(yǎng)3 d后測(cè)定根長(zhǎng)，煙草根長(zhǎng)在培養(yǎng)10 d后測(cè)定。不同土壤浸提液的化感自毒潛力計(jì)算同上。

1.5土壤化學(xué)物質(zhì)成分的GC-MS鑒定 不同土壤乙醇提取液硅烷化后，進(jìn)行GC-MS分析。GC-MS條件：氣相色譜質(zhì)譜儀為varinaic 240GC-450MS，色譜柱為FactorFourTM:capillary column VF-5ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm。程序升溫(乙醇)：初始溫度60 ℃，以15 ℃/min升至140 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升至200 ℃，保持15 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。總運(yùn)行時(shí)間41.33 min。程序升溫(氯仿)：初始溫度60 ℃，以10 ℃/min升至140 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。總運(yùn)行時(shí)間40.33 min。進(jìn)樣口溫度220 ℃，載氣：氦(He)，流量0.8 mL/L；進(jìn)樣量為1 μL。質(zhì)譜條件：EI電離方式，電子能量70 eV；阱溫200 ℃；阱外套溫度50 ℃；傳輸線溫度280 ℃；掃描范圍50～1 000 amu。用譜圖庫(kù)(NIST98 & WILEY)檢索確定各種化合物。

1.6數(shù)據(jù)分析 采用 DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行有關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、方差分析及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1烤煙根際土壤化感自毒潛力分析 土壤自毒潛力分析顯示，對(duì)照土壤處理下萵苣、煙草的根長(zhǎng)分別為2.22和0.59 cm，連作煙草根際土壤處理下則分別為1.03和0.34 cm(表1)，與對(duì)照相比，烤煙根際土壤對(duì)受體萵苣及煙草的抑制率分別為53.60%和42.37%?？梢娺B作烤煙根際土壤對(duì)受體萵苣及煙草具有較強(qiáng)的化感自毒潛力。進(jìn)一步分析土壤提取液對(duì)受體生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，烤煙根際土壤對(duì)受體萵苣及煙草的抑制率為45.96%和34.92%，說明烤煙根際土壤提取液對(duì)萵苣及煙草根長(zhǎng)生長(zhǎng)依然具有明顯的化感抑制作用。

2.2烤煙根際土壤化學(xué)物質(zhì)成分分析

2.2.1糖類物質(zhì)分析 GC、MS分析結(jié)果表明(表2)，對(duì)照土壤中存在7種糖類物質(zhì)，而連作煙草根際土壤中僅存在2種糖類物質(zhì)?？梢姛煵葸B作后，根際土壤糖類物質(zhì)發(fā)生顯著變化，種類明顯減少。

2.2.2酸類物質(zhì)分析 分析結(jié)果表明(表3)，對(duì)照土壤與連作煙草根際土壤中酸類物質(zhì)成分差異顯著。對(duì)照土壤中存在14種酸類物質(zhì)，連作煙草根際土壤中僅有3種酸類物質(zhì)?？梢姛煵葸B作后，煙草根際土壤酸類物質(zhì)種類顯著減少。

2.2.3酯類物質(zhì)分析 分析結(jié)果表明(表4)，對(duì)照土壤中存在16種酯類物質(zhì)，而連作煙草根際土壤中僅存在8種，且連作煙草根際土壤中檢測(cè)到的酯類物質(zhì)在對(duì)照土壤中均存在?？梢姛煵葸B作后，煙草根際土壤中酯類物質(zhì)種類明顯減少了一半。

2.2.4其他物質(zhì)分析 分析結(jié)果表明(表5)，對(duì)照土壤中檢測(cè)到1個(gè)醇類物質(zhì)，連作煙草根際土壤中檢測(cè)到12個(gè)其他物質(zhì)?？梢姛煵葸B作導(dǎo)致根際土壤物質(zhì)成分發(fā)生明顯變化。

表2 不同處理?xiàng)l件烤煙根際土壤糖類物質(zhì)成分

表3 不同處理?xiàng)l件烤煙根際土壤酸類物質(zhì)成分

表4 不同處理?xiàng)l件烤煙根際土壤酯類物質(zhì)成分

3 討論與結(jié)論

連作烤煙根系分泌物具有明顯的自毒作用，能夠顯著抑制煙草幼苗對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收與利用[11]。這與本研究發(fā)現(xiàn)連作烤煙根際土壤對(duì)受體植物萵苣、煙草幼苗具有明顯的化感自毒作用相一致。此外，本研究的土壤浸提液生物測(cè)試結(jié)果表明，連作烤煙根際土壤浸提液也具有明顯的化感自毒潛力，這與連作烤煙根際土壤中存在的自毒物質(zhì)密切相關(guān)。本研究通過GC-MS技術(shù)分析土壤浸提液化學(xué)成分表明，對(duì)照土壤中存在7種糖類物質(zhì)、14種酸類物質(zhì)、16種酯類物質(zhì)、1種其他類物質(zhì)；而連作烤煙根際土壤中存在2種糖類物質(zhì)、3種酸類物質(zhì)、8種酯類物質(zhì)、12種其他類物質(zhì)。連作烤煙根際土壤中存在的糖類、酸類及酯類物質(zhì)，在對(duì)照土壤中均可找到；連作烤煙根際土壤中則具有特異的12種物質(zhì)，其中有8種物質(zhì)與化感自毒作用相關(guān)，而對(duì)照土壤中僅存在1個(gè)醇類物質(zhì)。香草醛具有較強(qiáng)的化感潛力[12]。洋地黃毒素是一類具有較強(qiáng)毒害作用的毒性物質(zhì)[13]。水稻(Oryzasativa)根系分泌成分中的雪松醇在較低濃度下即可對(duì)受體萵苣具有較強(qiáng)化感潛力[14]。植酮、β-谷甾醇、膽甾烷醇、膽甾烷-3-酮等在一定濃度下也具有較強(qiáng)的化感自毒作用[15-17]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)連作烤煙根際土壤中存在特異的化學(xué)物質(zhì)——誘蟲烯，它能夠引誘植物害蟲并對(duì)自身生長(zhǎng)造成危害[18]?？梢姛煵蓍L(zhǎng)期連作后，根際土壤化學(xué)成分發(fā)生顯著的變化，土壤中存在大量與煙草自身化感自毒作用相關(guān)的物質(zhì)。

表5 不同處理?xiàng)l件烤煙根際土壤其他類物質(zhì)成分

綜上所述，煙草長(zhǎng)期連作導(dǎo)致其自毒作用加劇，而這種連作障礙加劇可能與煙草連作過程中分泌的自毒物質(zhì)及昆蟲引誘物有關(guān)。土壤是一個(gè)復(fù)雜的體系，煙草連作過程中自毒物質(zhì)釋放后需進(jìn)入土壤，而土壤中存在大量的微生物，自毒物質(zhì)釋放后是否需經(jīng)過微生物的吸收轉(zhuǎn)化，還是直接起作用，土壤中檢測(cè)到的自毒物質(zhì)其自毒作用濃度及范圍是多少，自毒物質(zhì)對(duì)土壤微生物多樣性及土壤酶活性的影響，還有待于進(jìn)一步深入探討。

[1]阮維斌,王敬國(guó),張福鎖,等.根際微生態(tài)系統(tǒng)理論在連作障礙中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),1999,1(4):53-58.

[2]Yu J Q.Autotoxic potential in vegetables crops[A].In:Narwal S S.Allelopathy Update:Basic and Applied Aspects[C].USA:Science Publisher,1999：149-162.

[3]張曉玲,潘振剛,周曉鋒,等.藥用植物的化感自毒作用與連作障礙[J].土壤通報(bào),2007,38(4):267-271.

[4]吳鳳芝,趙風(fēng)艷,谷思玉.保護(hù)地黃瓜連作對(duì)土壤生物化學(xué)性質(zhì)的影響[J].農(nóng)業(yè)系統(tǒng)科學(xué)與綜合研究,2002,18(1):20-22.

[5]呂衛(wèi)光,張春蘭.化感物質(zhì)抑制連作黃瓜生長(zhǎng)的作用機(jī)理[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,35(1):105-109.

[6]耿廣東,程智慧,張素勤.不同濃度的辣椒化感物質(zhì)對(duì)萵苣化感效應(yīng)研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2008,23(2):30-33.

[7]韓麗梅,沈其榮,鞠會(huì)艷,等.大豆地上部水浸液的化感作用及化感物質(zhì)的鑒定[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2002,22(9):1425-1432.

[8]張重義,林文雄.藥用植物的化感自毒作用與連作障礙[J].中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,17(1):189-196.

[9]陳冬梅.作物多樣性栽培對(duì)煙草連作障礙的生態(tài)調(diào)控機(jī)制[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2010.

[10]林瑞余,戎紅,周軍建,等.苗期化感水稻對(duì)根際土壤微生物群落及其功能多樣性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2007,27(9):3644-3654.

[11]郭亞利,李明海,吳洪田,等.烤煙根系分泌物對(duì)烤煙幼苗生長(zhǎng)和養(yǎng)分吸收的影響[J].植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2007,13(3):458-463.

[12]孔垂華,胡飛.植物化感作用及其應(yīng)用[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2004：105.

[13]劉衛(wèi)欣,盧兗偉,杜海濤,等.地黃及其活性成分藥理作用研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志,2009,36(4):277-280.

[14]He H B,Wang H B,Fang C X,etal.Herbicidal effect of a combination of oxygenic terpenoids on barnyardgrass (Echinochloacrus-galli)[J].Weed Research,2009,49:183-192.

[15]周家明,崔秀明,曾鴻超,等.三七根系分泌物的化學(xué)成分研究[J].特產(chǎn)研究,2009(3):37-39.

[16]馬君蘭,李成,魏穎,等.異黃酮的生物合成途徑及其調(diào)控[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,38(5):692-696.

[17]李楠.木本植物抑藻化感物質(zhì)的分離、抑藻機(jī)理及應(yīng)用效果研究[D].江蘇:揚(yáng)州大學(xué),2009.

[18]苗振旺,張鐘寧,王培新,等.外來入侵害蟲紅脂大小蠹對(duì)寄主揮發(fā)物的反應(yīng)[J].昆蟲學(xué)報(bào),2004,47(3):360-364.