李 順,王國良,賈春林,盛亦兵,孫 娟

(1.青島農業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109； 2.山東省農業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究所，山東 濟南 250110)

素有“牧草之王”、“維他命飼料”美譽的紫花苜蓿(Medicagosativa)作為當今世界范圍種植最廣泛、畜牧業(yè)利用最普遍的苜蓿栽培種之一，以其高植物蛋白含量、多礦物微量元素和全維生素種類等優(yōu)良動物營養(yǎng)特性，確立了其作為優(yōu)質草畜飼料獨一無二的地位[1-6]。為了應對當今畜牧業(yè)發(fā)展對優(yōu)質紫花苜蓿品種的育種需求，單純依靠傳統(tǒng)的大田混合雜交、集團選育等異花植物育種方法，無論在種質遺傳資源創(chuàng)新還是品種改良方面，都面臨日益捉襟見肘的境地。此外，紫花苜蓿異花授粉的特性，使其難于直接利用雜種優(yōu)勢，加之國內現有綜合品種群體遺傳特性差異潛力有限，唯有大力尋找具有顯著差異的育種資源群體進而結合細胞、分子等現代生物技術手段的輔助，才能有效開拓出一條紫花苜蓿品種改良和創(chuàng)新的有效路徑。

先鋒種業(yè)在英國、澳洲、新西蘭和北美地區(qū)主打的紫花苜蓿綜合品種54Q53(54Q53 Lucerne)具有高病蟲害抗性，中等抗寒(類似‘漫游者’)和中等秋眠(類似‘傳奇’)等級，可適于多種用途(干草、青飼和青貯等)，以及高飼用價值等特性[7-9]。此外，該品種是由225個隨機親本植株經混合隔離雜交(cage isolation)選育而成的品種，具有廣泛多樣的遺傳資源基礎，并適宜于北美北方大平原農、牧區(qū)，以及寒冷山區(qū)廣泛種植[8]。本研究利用組織培養(yǎng)的基本技術手段，嘗試建立來自54Q53紫花苜蓿的再生體系，重點研究影響苜蓿愈傷組織誘導的若干主要因子，進而建立該品種高效愈傷組織誘導體系，并進行初步再生分化試驗，為今后紫花苜蓿新品種的選育，遺傳資源豐富以及利用細胞融合等生物技術手段更深一步研究提供基礎研究材料[6]。

1 材料與方法

1.1試驗材料 54Q53紫花苜蓿種子由山東省農業(yè)科學院可持續(xù)發(fā)展研究所提供。

1.2試驗方法

1.2.1無菌苗及外植體獲取 用70%～75%乙醇和0.1%升汞對54Q53紫花苜蓿種子進行消毒后，接種到MS無激素培養(yǎng)基上獲取無菌苗。接種3～5 d，將下胚軸切取3 mm左右小段；接種7 d，將子葉去葉尖和尾部并橫向切成寬2～4 mm左右小條；接種20 d，將初生成真葉葉片去葉尖和葉尾橫向切成寬2～4 mm左右小條。

1.2.2細胞分裂素KT和6-BA對誘導54Q53紫花苜蓿愈傷組織的影響 以下胚軸為外植體，在MS基本培養(yǎng)基上，分別附加2.0 mg/L的2,4-D和0.1、0.5、2.0 mg/L的6-BA；2.0 mg/L 的2,4-D和0.1、0.5、2.0 mg/L的KT，一共6個處理，每個處理5個重復(5瓶)，每瓶接種外植體10塊，并于恒溫培養(yǎng)箱(25℃，光照16 h)中培養(yǎng)21 d，期間將意外染菌重復除去。最后，觀察不同細胞分裂素對誘導愈傷組織的不同反應。

1.2.3不同培養(yǎng)基和不同外植體對54Q53紫花苜蓿愈傷組織誘導的影響 固定附加2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA的4種基本培養(yǎng)基(MS、MSO、B5，改良SH)中，接種下胚軸，子葉，葉片3種外植體，共12個處理，每個處理5個重復(5瓶)，每個重復接種外植體10塊，然后，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(25℃，光照16 h)。第1周，每3 d觀察1次，以后每周觀察1次，記錄愈傷組織生長狀況。由于不同外植體材料差異，下胚軸、子葉和葉片分別于21、28 和32 d后，分別進行觀察、統(tǒng)計和分析。

1.2.4不同質量濃度組合的2,4-D與6-BA對誘導54Q53紫花苜蓿愈傷組織的影響 固定外植體為下胚軸，培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基(附加30 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，pH值為5.8)，設計紫花苜蓿愈傷誘導的2，4-D+6-BA質量濃度試驗組合：(A1-A2)0.5 mg/L+0.1、0.5 mg/L，(A3-A5)1.0 mg/L+0.1、0.5、1.0 mg/L；(A6-A9)1.5 mg/L+0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L；(A10-A13)2.0 mg/L+0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L；(A14-A17)3.0 mg/L+0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L。共17個處理，每個處理4個重復(4瓶)，每瓶接種外植體10個，恒溫培養(yǎng)箱(25℃，光照16 h)培養(yǎng)21 d后統(tǒng)計。

1.2.5愈傷組織分化試驗 分別驗證細胞分裂素KT(0.1、0.2、0.4、0.6 mg/L)和添加了0.1 mg/L NAA的KT(0.2、0.5、1.0、1.5 mg/L)組合在以MS、B5基本培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基(附加30 g/L蔗糖)上產生的分化效應。

1.3計數和統(tǒng)計方法

1.3.1計數方法

出愈愈傷塊判斷：外植體發(fā)生明顯膨大，且超過2/3的部分發(fā)生明顯脫分化的出愈愈傷塊為出愈愈傷。

褐化(壞死)愈傷塊判斷：超過整體愈傷塊1/2以上發(fā)生明顯褐化或黑壞死為褐化(壞死)愈傷。

愈傷塊總體大小判斷：設定直徑d>5.0 mm的愈傷組織為大愈傷；中愈傷為d=2.5～5.0 mm；小愈傷為d<2.5 mm。每個重復(每瓶)的大愈傷組織塊數占全部塊數超過2/3認為該重復愈傷組織表現的總體效應為“大”,若在1/2到2/3之間則為“中”，低于1/2為“小”；同理，一個處理所含所有重復數量占總數目超過2/3，1/2到2/3之間，低于1/2則認為該處理愈傷組織表現的總體效應為“大、中和小”，以此類推進行計數統(tǒng)計。

1.3.2統(tǒng)計方法

利用SPSS軟件對試驗數據結果進行分析：a)試驗采用SPSS軟件中t值配對測驗，分析(2.0 mg/L)2，4-D+(0.1、0.5、2.0 mg/L)KT或(0.1、0.5、2.0 mg/L)6-BA兩組愈傷組織誘導率數據。b)采用SPSS軟件方差分析中S-N-K方法,對試驗數據進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1細胞分裂素KT、6-BA對54Q53紫花苜蓿愈傷組織的誘導效應 培養(yǎng)21 d后發(fā)現，KT誘導愈傷組織的整體愈傷誘導率低于6-BA(圖1)，將KT與BA兩種不同細胞分裂素處理的愈傷組織誘導率結果進行獨立樣本t測驗，SPSS軟件分析結果顯示P<0.05，認為同質量濃度下KT和BA愈傷組織誘導率存在顯著差異，但未達到極顯著(P<0.01)水平。此外，KT誘導54Q53紫花苜蓿愈傷組織會引起特異性的白褐色稀軟愈傷，以及水漬化現象。所以，6-BA較KT更適合54Q53紫花苜蓿愈傷組織的誘導。

圖1 不同濃度KT和6-BA對愈傷組織誘導率的影響

2.2不同培養(yǎng)基和不同外植體對54Q53紫花苜蓿愈傷組織的誘導效應

2.2.154Q53紫花苜蓿最佳培養(yǎng)基和外植體組合 將下胚軸、子葉和葉片3種外植體(W)分別接種到MS、MSO、B5和改良SH四種基本培養(yǎng)基(P)上(固定附加2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA)進行愈傷誘導試驗，誘導愈傷組織統(tǒng)計結果表明(表1)：W1P1處理愈傷組織誘導率91.67%，相較W2P1處理愈傷組織誘導率無差異，但前者愈傷組織褐化率為6.67%較后者低，差異顯著(P<0.05)；較愈傷組織褐化率最低的W3P1處理，W1P1處理的愈傷組織誘導率更高，且差異也顯著。所以，最佳的外植體+培養(yǎng)基組合是下胚軸+MS。

表1 不同培養(yǎng)基和不同外植體誘導愈傷組織結果

2.2.2不同培養(yǎng)基對54Q53紫花苜蓿愈傷組織的誘導效應 不同的3種外植體接種到4種培養(yǎng)基上，發(fā)現愈傷組織誘導率都在MS培養(yǎng)基上最高(表1)，較適合作為愈傷組織誘導階段培養(yǎng)基。實際觀察中也發(fā)現B5和MSO培養(yǎng)基較MS更多出現各種異常愈傷組織，尤其是B5培養(yǎng)基上出現了紫色或深綠色的松脆顆粒，或墨綠硬殼片層，而進一步進行兩因素無重復方差分析的S-N-K多重比較發(fā)現MS同B5和MSO存在顯著性差異(P<0.05)，而改良SH與三者差異都不顯著，且MSO=B5微量+MS，可以推測微量元素對54Q53紫花苜蓿愈傷組織的誘導起到一定的作用。

2.2.3不同外植體對54Q53紫花苜蓿愈傷組織的誘導效應 3種外植體中脫分化最快的是下胚軸，大概3 d后發(fā)生且整個圓柱體膨大，誘導愈傷組織階段3周就必須繼代否則誘導過度愈傷整體質量急劇下降；而子葉大概需要5 d邊緣才明顯膨大，誘導階段可以持續(xù)到第4周；葉片最慢至少要7 d才會出現明顯的邊緣膨大，需要32 d才能完成誘導階段且其中外植體脫分化常發(fā)生中途終止。另外，下胚軸愈傷組織誘導階段發(fā)生異常分化情況最少，而子葉和葉片明顯增多，出現深綠或紫色愈傷，濃綠顆粒核心等。

3種外植體中下胚軸(W1)較子葉(W2)和葉片(W3)的愈傷組織誘導率高，而愈傷組織褐化率較子葉低(表1)，而進一步對3種外植體進行兩因素無重復方差分析的S-N-K多重比較也發(fā)現下胚軸同子葉和無菌苗真葉存在顯著性差異(P<0.05)，可見下胚軸是最佳外植體。

2.3優(yōu)化誘導54Q53紫花苜蓿愈傷組織2,4-D和6-BA的濃度組合 誘導培養(yǎng)21 d后，各處理中愈傷組織誘導率大于90.00%的有A6、A7、A11、A16、A17(表2)，而愈傷組織褐化壞死率低于10.00%的只有A11，可見A11(愈傷誘導率達到91.67%，愈傷組織褐化壞死率僅2.78%，正常愈傷組織誘導率88.89%)是最優(yōu)激素組合(表2)。

表2 2,4-D和6-BA濃度組合對愈傷誘導的影響

2.454Q53紫花苜蓿愈傷組織分化嘗試

2.4.1分化嘗試試驗結果 將前期嫩黃綠色的愈傷組織轉移到分化培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中(25℃，光照16 h)分化培養(yǎng)30 d，結果都未出現小芽但發(fā)生出根，并伴有愈傷組織異常分化現象(不同程度的濃綠愈傷組織，球形松脆愈傷帶綠核，晶體球狀愈傷，以及灰白色愈傷和褐化壞死等)。出根越多，根生長越強壯，這些異常分化發(fā)生程度就越輕、越少，可能存在一定的相關性。

2.4.2不同培養(yǎng)基、不同KT及NAA濃度對愈傷分化出不定根的影響 單獨使用KT或KT(0.1、0.2、0.4、0.6 mg/L)+NAA(0.1 mg/L)的MS培養(yǎng)基較B5培養(yǎng)基出根率更高，說明MS更適合54Q53的分化(圖2、3)。MS培養(yǎng)基上單獨添加KT或KT+NAA都出現KT在0.5 mg/L左右時有最高的出根率，本試驗中最高的出根率為40.00%，出現在MS+0.4 mg/L KT(圖2)，而添加NAA降低了MS上的出根率，并且單獨使用KT得到的根生長狀況也較好。

圖2 MS和B5培養(yǎng)基上不同KT質量濃度對出根率影響

圖3 附加0.1 mg/L NAA的不同培養(yǎng)基(MS和B5培養(yǎng)基)上不同KT質量濃度對出根率影響

3 討論與結論

3.1不同細胞分裂素對54Q53紫花苜蓿愈傷組織誘導的影響 參考以往紫花苜蓿愈傷組織誘導研究發(fā)現[10]，生長素2,4-D起關鍵作用為必須因子，而起次要輔助作用的常用細胞分裂素有2種：KT和6-BA，其主要作用是促進細胞分裂及引起芽分化等[11]。很多研究都支持不同品種苜?？赡軐Σ煌毎至阉禺a生不同效應，當然其中也有很多沒有差異的報道[12-13]。黃遠新等[3]同時使用以上2種細胞分裂素誘導南方紫花苜蓿也得到較好的誘導效果，可見不同細胞分裂素本身對紫花苜蓿愈傷誘導可能既存在各自的特異性，也存在互相增減的復雜效應。本研究針對54Q53紫花苜蓿愈傷誘導的特異性試驗發(fā)現，該品種對兩者的確存在差異且6-BA較KT在3個濃度下都呈現誘導愈傷組織較佳的表現，尤其是KT誘導54Q53紫花苜蓿愈傷組織時會普遍造成愈傷的白褐色水漬化。

3.2不同培養(yǎng)基和不同外植體對愈傷組織誘導的影響 本研究分別對4種培養(yǎng)基和3種外植體進行組合處理試驗，結果表明，培養(yǎng)基MS與B5(或MSO)存在顯著差異(P<0.05)，比較培養(yǎng)基組成發(fā)現B5微量+MS基本培養(yǎng)基=MSO，而MSO同B5沒有顯著差異，說明MS同B5由于微量元素存在而足以影響愈傷誘導效果。之前很多報道指出銨離子對愈傷組織以及胚狀體誘導有明顯作用[14]，但在本研究中作用有限；此外，雖然有機成分也存在一定差異，但SPSS軟件統(tǒng)計顯示MSO與B5之間未達到顯著差異。

植物不同組織器官和部位的細胞生理狀態(tài)和再生能力等都存在明顯差異[13]。一般比較下胚軸，子葉和葉片3種外植體中無論是在愈傷組織誘導速率還是質量上都是下胚軸最優(yōu)[12-16]，本試驗與前人報道一致。

3.3不同2,4-D和6-BA激素濃度組合對愈傷組織誘導的影響 紫花苜蓿愈傷誘導中生長素2,4-D起主要作用[14-16]，而6-BA起一定的輔助作用。而在參考以往研究文獻基礎上，發(fā)現最佳激素組合一般都是生長素濃度高于細胞分裂素濃度，本研究組合將生長素質量濃度設定為4個水平，即過高(3.0 mg/L)，高(2.0 mg/L)、中(1.0～1.5 mg/L)、低(0.5 mg/L)，而細胞分裂素也設定為過高(2.0 mg/L)、高(1.0 mg/L)、中(0.5 mg/L)、低(0.1 mg/L)4個水平。結果發(fā)現，高水平生長素+中水平細胞分裂素為最優(yōu)化組合。

其他報道研究[17-20]也證明在高質量濃度生長素水平與中(低)質量濃度細胞分裂素水平搭配能得到較理想的愈傷組織。過高的2,4-D會造成愈傷過度脫分化，過低則脫分化無力；過高的6-BA會造成異常分化，過低則起不到穩(wěn)定生長素效應，促進細胞分裂和幫助愈傷組織適當分化的作用。

3.4異常分化生根的影響因子 針對B5和MS培養(yǎng)基對誘導愈傷組織的不同效果，分別使用單獨KT或添加NAA(0.1 mg/L)進行分化嘗試，雖然沒能得到再生苗，但發(fā)現不同培養(yǎng)基，不同KT濃度，以及是否添加NAA對出根率和根的生長都產生一定的影響，其中MS較B5更適合，而KT在0.5 mg/L時較好，并且高出根率伴隨著較佳的再生根生長狀況，說明存在一定的再分化作用，可以進一步細化激素種類組合、培養(yǎng)基蔗糖含量、有機添加物、培養(yǎng)條件優(yōu)化等進行進一步的再生分化試驗[21-22]。

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