劉迎春，劉志林，向畑恭男

(1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海 湟源 812009； 2.高知工科大學(xué)物質(zhì)環(huán)境科學(xué)系，日本 高知 780-0000)

在高寒退化草地上建植栽培草地，土壤養(yǎng)分直接影響植物生長(zhǎng)和栽培草地的建植。高寒草地土壤養(yǎng)分的特點(diǎn)是，有機(jī)質(zhì)含量高，其含量高于4%的土壤占高寒地區(qū)的38%；速效養(yǎng)分含量低，速效氮低于93 mg/kg的土壤占高寒地區(qū)的54%，速效磷含量低于6 mg/kg的土壤占高寒地區(qū)的96%[1]。在高寒氣候條件下，土壤微生物的種類和數(shù)量較少，而且全年只有近2個(gè)月生長(zhǎng)較活躍期[2-4]。隨著退化草地營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)量減少，土壤微生物種類和數(shù)量更是大大降低[5]。高寒退化草地上建植栽培草地的經(jīng)驗(yàn)表明，建植的第2-3年，草地生產(chǎn)力持續(xù)上升，但自第4年起出現(xiàn)大幅度的下降[6-7]。其原因之一是施化肥不能改良土壤環(huán)境使牧草持久增產(chǎn)。所以調(diào)控土壤微生物的活性，是改良高寒草地土壤性能、持續(xù)提供養(yǎng)分、確保草地持續(xù)生產(chǎn)力的關(guān)鍵。

植物根系與土壤微生物之間關(guān)系密切，根系分泌物和微生物殘?bào)w，都為土壤增添有機(jī)質(zhì)，微生物分解有機(jī)質(zhì)為植物生長(zhǎng)提供速效養(yǎng)分。提高根際微環(huán)境中的微生物的生長(zhǎng)和活性，可以促進(jìn)植物和微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)土壤環(huán)境可循環(huán)的良性發(fā)展。退化土地改良中，施用固氮菌和溶磷菌[8]或EM菌肥[9]可改良土壤微生物和根際養(yǎng)分。禾本科作物根際施固氮菌[10]或酵母菌[11]，種子產(chǎn)量提高60%～91%。梁寧[12]發(fā)現(xiàn)，在貧瘠的土壤表層噴灑脫鹽單細(xì)胞海洋微藻懸浮液后，土壤各層的微生物活性均提高。用廢紙漿、脫鹽單細(xì)胞海洋微藻粉沫和土壤微生物混合物將林木種子包裹成顆粒，將顆粒置于木樁孔眼中，把木樁打入貧瘠的土壤表層，林木種子的發(fā)芽率和樹(shù)苗的生長(zhǎng)都顯著改善[13]。

本研究利用植物性吸水材料和微藻粉包衣種子，并接種微生物孢子，分析包衣材料和微藻體是否可以為微生物提供生長(zhǎng)必需的養(yǎng)分，使土壤微生物的活性提高，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)；以及包衣材料對(duì)土壤微生物活性的促進(jìn)作用是否可以延續(xù)，以期通過(guò)種子包衣和接種微生物孢子來(lái)改善根際周圍的土壤肥力。

1 材料與方法

1.1牧草種 垂穗披堿草(Elymusnutans)和山野豌豆(Viciaamoena)，均由青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院種子庫(kù)提供。

1.2種子包衣材料和包衣方法 包衣材料來(lái)源于植物的親水膠如黃原膠、羧甲基纖維素鈉和角叉膠，以及單細(xì)胞海洋微藻(Phaeocystissp.neconon-1)粉沫。單細(xì)胞海洋微藻采自日本沖繩島，在添加Eppley’s營(yíng)養(yǎng)液的人工海水中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照1 600 lx、室溫、持續(xù)充氣，培養(yǎng)4周后，離心過(guò)濾收集，淡水沖洗脫鹽4遍，65℃烘干，研磨成粉末；藻體質(zhì)量的50%是細(xì)胞外多糖包膜，具有很強(qiáng)的吸水性，藻粉的60%為有機(jī)物，37%為無(wú)機(jī)物[14]。為了觀察微藻對(duì)植株生長(zhǎng)的影響，本研究采用兩種混合物包衣種子：1號(hào)混合物中含有微藻(簡(jiǎn)稱：微藻+)，2號(hào)混合物中不含微藻(簡(jiǎn)稱：微藻-)，混合物成分見(jiàn)表1。用兩種包衣混合物手工完成兩種牧草的種子包衣。

表1 兩種包衣混合物的成分 %

1.3微生物 本研究采用曲霉屬曲霉真菌(Aspergillusspp.)和鏈霉屬放線菌(Streptomycesspp.)。用廢紙漿和微藻混合物壓成2 mm厚的薄片，將濕薄片置于高寒草地土壤表面，每天澆水4～5次，用玻璃罩罩住濕潤(rùn)的薄片。8 d后，薄片上著生了曲霉菌和鏈霉菌的菌落，分別將曲霉菌黑色的分生孢子和鏈霉菌白色的孢子從薄片上刮下來(lái)，接種在馬鈴薯(Solanumtuberosum)瓊脂培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)14 d后，再將曲霉菌分生孢子和鏈霉菌孢子分別接種在新馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，反復(fù)分離3次。最后用含有0.01% Triton X-100的0.85% 的鹽水，將培養(yǎng)基上黑色和白色的孢子分別沖洗下來(lái)，高速離心濃縮孢子懸浮液， -20℃下儲(chǔ)存。兩種孢子的懸浮液按1∶1的比例混合，孢子濃度為1.7×106孢子/mL(簡(jiǎn)稱為×1孢子)，稀釋10倍后孢子濃度為1.7×105孢子/mL(簡(jiǎn)稱為×0.1孢子)，無(wú)孢子懸浮液(簡(jiǎn)稱為×0孢子)。-20℃儲(chǔ)存的孢子解凍后，在包衣材料制成的培養(yǎng)基上的萌發(fā)率為96%～98%(未顯示試驗(yàn)數(shù)據(jù))。為了考察微生物孢子的作用，按3個(gè)劑量接種孢子：×1、×0.1和×0孢子(對(duì)照)，將包衣種子在3種孢子劑量的懸浮液中浸泡1 min后馬上播種。

1.4土壤呼吸量的測(cè)定 土壤取自海拔3 000 m的高寒草地。通過(guò)土壤呼吸量的測(cè)定確定土壤微生物活性。測(cè)定方法如下：兩個(gè)體積相同的密閉玻璃瓶，用內(nèi)徑為3 mm塑料管連接，塑料管上連接一個(gè)電子微壓傳感器(KYOWA,PDV-10GA)，傳感器的輸出端連接一個(gè)記錄器。兩個(gè)玻璃瓶底部都盛有10 mL 4 mol/L的KOH。將盛有5 g土樣的小玻璃碗分別放入兩個(gè)玻璃瓶中，其中給一個(gè)玻璃瓶的土樣中注入700 mg/mL的葡萄糖溶液5 mL，另一個(gè)玻璃瓶的土樣注入蒸餾水，4～5 min后，連接的電子微壓傳感器的記錄器上開(kāi)始顯示壓力差，因?yàn)橥寥牢⑸锓纸馄咸烟沁^(guò)程中產(chǎn)生的CO2，被瓶底部的KOH吸收生成K2CO3，因而壓力降低，兩邊玻璃瓶的壓力出現(xiàn)壓力差，顯示在記錄器上。將高寒草地土壤在120℃下高壓滅菌40 min，再與不同比例的高寒草地土壤混合，用這套測(cè)量?jī)x測(cè)定各種土壤樣品的壓差，確定測(cè)量?jī)x的靈敏度、穩(wěn)定性和土壤微生物活性的線性關(guān)系?？捎猛寥牢⑸锖粑a(chǎn)生的CO2(mL/min)表示微生物的呼吸量。

1.5微藻和孢子對(duì)牧草生長(zhǎng)的影響(試驗(yàn)1) 于2009年5月6日-7月24日在青海省湟源縣青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)地進(jìn)行，海拔2 665 m， 36°41′ N，101°15′ E。將100粒包衣并接種微生物孢子的兩種種子播種在花盆(直徑×高=19.5 cm×20.0 cm)土壤中，不覆土，花盆置于室外屋檐下，以便于控制植物生長(zhǎng)過(guò)程中的水分。試驗(yàn)期的溫度為9～27℃，平均日照時(shí)數(shù)7.2 h/d。每2 d每花盆澆水300 mL，通過(guò)稱量烘干(12 h)土壤，測(cè)得土壤水分含量為15%～18%，這是模擬高寒草地土壤水分條件[15]。每天早晨觀察種子出苗情況，當(dāng)胚芽鞘的長(zhǎng)度為1 mm 時(shí)視為種子出苗。每盆中保留10個(gè)最早出苗的植株，生長(zhǎng)80 d后，挖出植株, 數(shù)山野豌豆的根瘤數(shù)，60℃烘干2 h，稱植株干質(zhì)量。植株從花盆中收獲后，立即測(cè)定土壤的呼吸量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6微藻和孢子對(duì)牧草生長(zhǎng)和土壤微生物的持續(xù)作用(試驗(yàn)2) 試驗(yàn)1花盆中的牧草生長(zhǎng)80 d收獲后(第1茬)，土壤仍留在原花盆中，播撒未包衣、未接種微生物孢子的兩種牧草種子。本試驗(yàn)包括4個(gè)處理，處理1、2、3分別為微藻粉+包衣,并接種3個(gè)不同劑量孢子(×1、×0.1、×0)的第1茬牧草的花盆；處理4為未包衣、未接種孢子的第1茬牧草的花盆；用新土花盆為對(duì)照。試驗(yàn)于2009年7月25日-9月26日在青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)地進(jìn)行。試驗(yàn)期內(nèi)的溫度5～32℃，平均日照時(shí)數(shù)6.6 h/d，每2 d每花盆澆水300 mL，10個(gè)最早出苗的植株留在花盆中，生長(zhǎng)60 d后，挖出植株，數(shù)山野豌豆的根瘤數(shù)，60℃烘干2 h，稱量植株干質(zhì)量。植株從花盆中收獲后(第2茬)，立即測(cè)定土壤的呼吸量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 用SAS 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用兩因素和單因素方差分析法，分析出苗率、植株干質(zhì)量、根瘤數(shù)和土壤呼吸量。種子出苗率數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)反正弦轉(zhuǎn)換后，用于方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1包衣混合物中的微藻和微生物孢子對(duì)牧草生長(zhǎng)的影響 包衣種子的出苗率均極顯著地高于未包衣種子(P<0.01)，不同包衣混合物和接種孢子劑量，也導(dǎo)致了出苗率的極顯著差異(P<0.01)(表2)。當(dāng)包衣混合物中含有藻粉、孢子劑量為×1時(shí)，植株的干物質(zhì)量達(dá)到最高值，垂穗披堿草植株為184 mg/株，山野豌豆為156 mg/株(P<0.01)；山野豌豆的根瘤數(shù)達(dá)到最高值(P<0.01),為25個(gè)/株，方差分析表明包衣混合物中的微藻與孢子兩個(gè)因素之間存在互作關(guān)系。說(shuō)明微藻和孢子對(duì)兩種牧草生長(zhǎng)的促進(jìn)作用缺一不可，可能微藻粉和孢子的互相作用，提高了土壤微生物的活性。另外,不論哪種植物，當(dāng)混合物含有微藻粉并接種孢子時(shí)(微藻+、×1孢子和微藻+、×0.1孢子)，土壤的呼吸量極顯著地高于其他處理(P<0.01)，而且植株的干物質(zhì)量與土壤呼吸量之間存在著極顯著的正相關(guān)關(guān)系(垂穗披堿草：R2=0.987，P<0.001；山野豌豆：R2=0.942，P<0.001)，山野豌豆的根瘤數(shù)與土壤呼吸量之間也存在著極顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.892,P<0.001)。證明植株生長(zhǎng)量的增加是土壤微生物活性提高所致，包衣混合物中微藻粉和微生物孢子的相互作用直接或間接地提高了植株生長(zhǎng)量。

表2 種子包衣、微藻和微生物對(duì)兩種牧草種子出苗率、植株干質(zhì)量、根瘤數(shù)和土壤呼吸量的影響

本試驗(yàn)采用土壤曲霉真菌和放線菌。高寒草地土壤真菌的生物量最大，其次是放線菌[16]，因此采用的曲霉真菌和放線菌引發(fā)了土壤微生物活性和植株生長(zhǎng)的提高。玉米(Zeamays)植株的根際土壤中分離出固氮和溶磷的細(xì)菌，試驗(yàn)室擴(kuò)繁后，再將這些細(xì)菌回歸根際土壤，玉米籽粒產(chǎn)量顯著提高[17]。在石灰礦區(qū)植被恢復(fù)中，將土壤中分離出的真菌在試驗(yàn)室進(jìn)行擴(kuò)大繁殖，再將該真菌接種于種子上，植株生長(zhǎng)量顯著高于對(duì)照[18]。園藝植物培養(yǎng)液中添加固氮菌，促進(jìn)了植物生長(zhǎng)[19]。植物根際的土壤微生物被分離出來(lái)，經(jīng)過(guò)繁殖擴(kuò)增再回歸土壤環(huán)境。而在本研究中，不僅分離并異地繁殖擴(kuò)增了土壤微生物，而且以種子包衣作為載體，將土壤微生物大量地回歸植物根際，人為地加入了植物性親水膠和藻粉，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供碳、氮、磷和鉀的營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)而改善了根際營(yíng)養(yǎng)條件。包衣材料中的微藻和微生物導(dǎo)致土壤微生物的活性提高和植株的生長(zhǎng)。

包衣種子出苗率全部高于未包衣種子，說(shuō)明種子包衣僅促進(jìn)了種子的早期萌發(fā)，提高出苗率，而后期植株生長(zhǎng)則有賴于包衣混合物中的藻粉與微生物之間的相互作用。

2.2包衣混合物的微藻和孢子對(duì)植物生長(zhǎng)和土壤微生物活性的持續(xù)作用 第1茬種子處理效應(yīng)均表現(xiàn)在第2茬植物的干質(zhì)量和根瘤數(shù)上，如果第1茬包衣種子含有微藻和微生物孢子時(shí)(微藻+、孢子×1或0.1)，第2茬植物植株的干質(zhì)量極顯著地增加(P<0.01)，山野豌豆的根瘤數(shù)也極顯著地增加(P<0.01)(表3)。兩種植物，第1茬包衣種子含有微藻時(shí)，收獲第2茬后土壤呼吸量均顯著提高(P<0.05)。同樣，第2茬植株的干物質(zhì)量與土壤呼吸量之間也存在著顯著的正相關(guān)的關(guān)系(垂穗披堿草為R2=0.719，P<0.001；山野豌豆為R2=0.982 ，P<0.001)，山野豌豆的根瘤數(shù)與土壤呼吸量之間也有極顯著的正相關(guān)(R2=0.989,P<0.001)。證明第1茬植株收獲后，因?yàn)槟承┪镔|(zhì)如土壤微生物等留在了土壤中，包衣混合物的微藻和孢子引發(fā)了土壤微生物的大量繁殖，改變了根際環(huán)境，這種效應(yīng)持續(xù)到后續(xù)的植株生長(zhǎng)過(guò)程中。另外，植物根系分泌物可以活化礦物質(zhì)養(yǎng)分、促進(jìn)植物吸收土壤養(yǎng)分；細(xì)胞和組織的脫落物等，又是土壤微生物的能源物質(zhì)，通過(guò)影響土壤微生物的數(shù)量和活性，對(duì)土壤中的養(yǎng)分元素起到了間接的活化作用[20]。這種良性循環(huán)使得土壤環(huán)境得以改善。

表3 微藻粉和微生物對(duì)兩種牧草植株干質(zhì)量、根瘤數(shù)和土壤呼吸量的持續(xù)影響

種子微藻包衣并接種微生物孢子，提高了植株根際土壤微生物活性和植物生長(zhǎng)，并且誘導(dǎo)了土壤環(huán)境和植物生長(zhǎng)的持續(xù)改善和提高。植株根際藻和微生物相互作用的機(jī)理、以及對(duì)植株生長(zhǎng)影響的機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。

[1] 林永昌.青海省土壤資源評(píng)析[A].青海省草原總站資料選編(第三集)[C].西寧：青海人民出版社,1992：43-46.

[2] 王啟蘭，楊濤.高寒草甸土壤氮素代謝作用強(qiáng)度的研究[A].高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)(第四集)[M].北京：科學(xué)出版社，1995：179-184.

[3] 王啟蘭，李家藻.高寒草甸不同植被土壤真菌生物量的季節(jié)動(dòng)態(tài)[A].高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)(第四集)[M].北京：科學(xué)出版社，1995：169-176.

[4] 熊毅.中國(guó)土壤[M].第二版.北京：科學(xué)出版社，1987：284-303.

[5] 尚占環(huán)，丁玲玲，龍瑞軍，等.江河源區(qū)退化高寒草地土壤微生物與地上植被及土壤環(huán)境的關(guān)系[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2007,16(1):34-40.

[6] 李希來(lái)，黃葆寧.“黑土灘”退化草地補(bǔ)種禾草和嵩草試驗(yàn)初報(bào)[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,1996(4)：9-11.

[7] 黃葆寧，李希來(lái).利用嵩草屬優(yōu)良牧草恢復(fù)“黑土灘”植被試驗(yàn)研究報(bào)告[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,1996(1)：1-5.

[8] Wu S C,Cao Z H,Li Z G,etal.Effects of biofertilizer containing N-fixers, P and K solubilizers and AM fungi on maize growth:a green house trial[J].Geoderma,2005,125(1/2):155-166.

[9] Xu H L.Effect of a microbial inoculant and organic fertilizers on the growth, photosynthesis and yield of sweet corn[J].Journal of Crop Production,2000,3:183-214.

[10] Nandi A S， Sen S P.Utility of some nitrogen-fixing microorganisms in the phylloshere of crop plants[J].Plant and Soil,1981,63(3):465-476.

[11] Kobayashi M,Torigai Y,Takashi E.Effect of yeast on higher plants[J].Plant and Soil,1980,57(1):41-47.

[12] 梁寧.海洋微藻Phaeocystissp.對(duì)退化土地微生物的影響——一種改良退化土地的嘗試[D].Kochi:Kochi Uniersity of Technology,2003.

[13] Kobayashi A.An attempt to create a plantation pile[D].Kochi:Kochi University of Technology, 2007.

[14] Kurachi J.Physiological analysis of a unicellular marine microalga,Phaeocystissp.necolon 1[D].Kochi:Kochi University of Technology,2003.

[15] 李希來(lái).青海省南部退化草地土壤特性調(diào)查[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，1994(3):7-12.

[16] 張成霞，南志標(biāo).放牧對(duì)草地土壤微生物影響的研究述評(píng)[J].草業(yè)科學(xué),2010,27(1):65-70.

[17] Mehnaz S,Lazarovits G.Inoculation effects ofPseudomonasputida,Gluconacetobacterazotocaptans, andAzospirillumlipoferumon corn plant growth under greenhouse conditions[J].Microbial Ecology,2006,51:326-335.

[18] Rao A,Tak R.Growth of different tree species and their nutrition uptake in limestone mine spoils as influenced by arbuscular mycorrhizal (AM) fungi in Indian arid zone[J].Journal of Arid Environment,2002,51:113-119.

[19] Perner H,Schwarz D,George E.Effect of mycorrhizal inoculation and compost supply on growth and nutrition uptake of young leek plants grown on peat-based substrates[J].HortScience,2006,41(3):628-632.

[20] 吳彩霞，傅華.根系分泌物的作用及影響因素[J].草業(yè)科學(xué),2009,26(9):24-29.