劉曉云，郭振國(guó)，楊亞男，劉桂霞，王 娜，戴燕燕，王易鵬，郭小葉，魏 爽

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002；2.河北省保定市第三中學(xué)，河北 保定 071002； 3.西南林學(xué)院保護(hù)生物學(xué)院，云南 昆明 650224)

小葉錦雞兒(Caraganamicrophylia)是豆科蝶形花亞科錦雞兒屬植物，別名小檸條、牛筋條，我國(guó)是主要分布地區(qū)，從東北的呼倫貝爾草原到西北的甘肅等地都有自然分布[1]。小葉錦雞兒具有抗旱、耐寒、耐貧瘠的特點(diǎn)[2]，為固定、半固定沙地的優(yōu)勢(shì)種[3]；同時(shí)兼具有豐富的營(yíng)養(yǎng)，是牲畜的良好飼料，它是集“生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益”于一體的“三效合一”樹(shù)種[4]。目前，小葉錦雞兒在內(nèi)蒙古科爾沁沙地[3]及內(nèi)蒙古半干旱草原地區(qū)[5]、遼西地區(qū)[4]、河北宣化黃羊?yàn)6]等地得到應(yīng)用，用于植被恢復(fù)、保育土壤、以及飼料防護(hù)林的培育工作。

地木耳(Nostoccommune)是一種地衣，俗稱地軟、地皮菜，是真菌和藻類的共生結(jié)合體，屬自養(yǎng)植物，可進(jìn)行光合作用，在我國(guó)各地均有廣泛分布[7]。已有研究表明，地木耳提取液可有效提高小麥(Triticumaestivum)[8]、石竹(Dianthuschinensis)和孔雀草(Tagetespatula)[9]等種子的萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)；王靜等[10-11]研究了地木耳對(duì)土壤含氮量的影響，并將其作為肥料分別施用于馬鈴薯(Solanumtuberosum)及番茄(Lycopersiconesculentum)，觀察其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)及開(kāi)花情況。結(jié)果表明，施用地木耳可增加土壤中的含氮量，并證實(shí)了它可以利用自身的碳源物質(zhì)進(jìn)行固氮作用，向周圍環(huán)境泌氨，具有明顯的增肥作用，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)已有地木耳的人工培育機(jī)構(gòu)[12]。地木耳的這些優(yōu)點(diǎn)可考慮應(yīng)用在小葉錦雞兒的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)上，國(guó)內(nèi)尚無(wú)這方面的研究。由于小葉錦雞兒是豆科植物，具有豆科植物共生固氮的特點(diǎn)，可以與根瘤菌形成根瘤，進(jìn)行生物固氮以獲取氮素營(yíng)養(yǎng)，目前對(duì)小葉錦雞兒根瘤菌的研究已有許多報(bào)道[13-15]。在菌劑應(yīng)用方面，劉振龍和蔡安國(guó)[16]的研究表明小葉錦雞兒接種根瘤菌后，能顯著地提高植株幼苗的結(jié)瘤率，使其能更早地共生固氮，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

鑒于小葉錦雞兒的栽培和經(jīng)濟(jì)價(jià)值以及根瘤菌菌劑與地木耳提取液對(duì)植物生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用，本研究將這2種微生物制劑應(yīng)用在小葉錦雞兒幼苗生長(zhǎng)上，以研究其對(duì)該植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，探討其應(yīng)用在小葉錦雞兒種植和栽培上的可行性，為該植物應(yīng)用在干旱草原和沙化土壤的植被恢復(fù)中提供生物肥料。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用地木耳以及小葉錦雞兒根瘤菌、小葉錦雞兒種子，均由河北大學(xué)河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.1地木耳提取液的制備 新鮮地木耳(2010年5月采集于河北張家口沽源牧場(chǎng))用水洗凈后，60℃烘干、粉碎，準(zhǔn)確稱取0.1 g加入到1 L水中，用NaOH調(diào)節(jié)其pH值為10.0；80℃水解4 h，過(guò)濾取上清液，將濾渣重復(fù)水解一次，取上清液；將兩次上清液濃縮至100 mL，即得原液；用蒸餾水依次稀釋得到1/10原液、1/20原液、1/50原液。

1.1.2根瘤菌菌劑的制備 將小葉錦雞兒根瘤菌菌株HBU037001、HBU037002、HBU037003分別在YMA平板上活化后保存至斜面，然后接種于盛有100 mL YMA液體培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，于28℃恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)48 h即得根瘤菌液體菌劑。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1盆栽試驗(yàn) 精選飽滿的小葉錦雞兒種子，95%乙醇浸泡3 min，0.1%氯化汞表面消毒5 min，用無(wú)菌水將消毒后的種子洗滌3～5遍。

分別用地木耳提取液原液、1/10原液、1/20原液、1/50原液4種劑量的地木耳提取液分別浸種6 h，并用蒸餾水進(jìn)行相同處理作為對(duì)照組。

將種子播入花盆中，每盆播20粒種子，覆土1～2 cm，每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共15盆，每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)當(dāng)天出苗數(shù)量；當(dāng)種子不再萌發(fā)時(shí)，每盆保留5株長(zhǎng)勢(shì)較好且一致的幼苗，每2 d分別用等量的不同劑量地木耳提取液噴施幼苗，用蒸餾水噴灑對(duì)照組植物。生長(zhǎng)20 d后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，測(cè)定株高(從子葉痕處至離生長(zhǎng)點(diǎn)最近的展開(kāi)葉頂端，每盆測(cè)量5株)、地上生物量(以第1片子葉葉痕處作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，植物樣品先在烘箱中120℃殺青40 min，后于60℃烘干至質(zhì)量恒定，每盆測(cè)量5株)、葉面積(將植株的葉片全部剪下，放在坐標(biāo)紙上，統(tǒng)計(jì)葉片所占的格數(shù)，然后得出每株植物葉面積總數(shù)值，每盆測(cè)量5株)。

1.2.2田間試驗(yàn) 選擇地木耳提取液原液的1/10、1/20和1/50共3個(gè)劑量處理，3個(gè)不同的根瘤菌菌劑處理及地木耳提取液和根瘤菌菌劑聯(lián)合處理9個(gè)組合，共15種處理；采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)樣方，每個(gè)樣方2 m×2 m，另設(shè)不進(jìn)行地木耳和根瘤菌菌劑處理的空白對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

每個(gè)處理的播種量為55 g，約為1 200粒種子；將小葉錦雞兒的種子用地木耳提取液或根瘤菌菌劑分別浸泡6 h，播種時(shí)，用干燥的土壤將種子拌勻；地木耳和根瘤菌菌劑聯(lián)合處理時(shí)，先將小葉錦雞兒的種子用地木耳提取液浸泡6 h，再用菌劑處理2 h；每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)當(dāng)天出苗數(shù)量，每3 d分別用等量的不同濃度地木耳提取液噴施幼苗，其他處理及對(duì)照用蒸餾水噴灑葉面，50 d后觀察生長(zhǎng)情況，指標(biāo)測(cè)定方法同室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，每個(gè)重復(fù)測(cè)定10株植物。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 通過(guò)SPSS 13.0數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)；在滿足方差齊性的情況下，再利用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，確定各因子內(nèi)部不同水平平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1盆栽試驗(yàn) 對(duì)盆栽生長(zhǎng)20 d的小葉錦雞兒的種子出苗率、株高、干質(zhì)量和葉面積進(jìn)行了測(cè)定，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，地木耳提取液對(duì)小葉錦雞兒的出苗率、株高和生物量均有顯著影響(P<0.01)。地木耳提取液原液對(duì)小葉錦雞兒的出苗率有明顯的抑制作用，1/20和1/50的稀釋液對(duì)出苗率的影響較對(duì)照和其他處理差異顯著(P<0.01)，1/20稀釋液的效果最好，出苗率可達(dá)48.3%；處理后獲得的植株株高與對(duì)照相比均具有顯著差異(P<0.01)，而各個(gè)處理之間的株高值無(wú)顯著差異(P>0.01)。

從生物量來(lái)看，各個(gè)處理與對(duì)照相比差異顯著，相比對(duì)照提高7.8%～21.9%，其中1/20的稀釋液提高幅度最大，與其他處理之間差異顯著(P<0.01)；比較其對(duì)葉面積的影響，1/20稀釋液與其他處理均差異顯著(P<0.01)，葉面積數(shù)值最高。

表1 盆栽試驗(yàn)地木耳提取液對(duì)小葉錦雞兒出苗及生長(zhǎng)的影響

2.2田間試驗(yàn) 由盆栽試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地木耳原液對(duì)種子的萌發(fā)起抑制作用，因此田間試驗(yàn)選取了1/10、1/20和1/50的地木耳稀釋液；選擇根瘤菌菌株HBU037001、HBU037002和HBU037003制作菌劑；種子經(jīng)過(guò)表面處理后播種，2 d后開(kāi)始出苗，植物生長(zhǎng)到50 d開(kāi)始測(cè)量植株高度、葉面積、生物量等指標(biāo)。

統(tǒng)計(jì)分析表明，地木耳提取液和根瘤菌菌劑對(duì)小葉錦雞兒的出苗率、株高、生物量和葉面積均有顯著影響(P<0.01)。

表2 田間試驗(yàn)地木耳提取液及根瘤菌菌劑對(duì)小葉錦雞兒出苗及生長(zhǎng)的影響

根瘤菌菌劑HBU037001和HBU037002對(duì)種子的出苗率影響較其他處理顯著，菌劑HBU037001處理種子出苗率最高，在90%以上；地木耳提取液中，1/20稀釋處理出苗率較好，達(dá)到73.8%，其他各處理也均比對(duì)照有所提高。比較3種不同的處理方式，1/50地木耳提取液、根瘤菌菌劑HBU037001以及聯(lián)合處理1/10地木耳提取液與菌劑HBU037001等較對(duì)照相比，株高差異顯著(P<0.01)，其中根瘤菌菌劑HBU037001處理的植物株高最高。

從生物量來(lái)看，1/20地木耳提取液、菌劑HBU037002等對(duì)小葉錦雞兒的生物量較對(duì)照具有顯著的差異，較對(duì)照分別提高11.5%和17.7%；綜合來(lái)看，地木耳提取液1/10與菌劑HBU037001的聯(lián)合處理又較其他處理差異顯著，生物量提高達(dá)到28.2%。在葉面積的測(cè)定中，1/20、1/10稀釋的地木耳提取液、菌劑HBU037002以及聯(lián)合處理1/10地木耳提取液+菌劑HBU037001等較對(duì)照具有顯著差異，其中1/20稀釋的地木耳提取液效果最好，相比對(duì)照提高42.8%。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，不同的根瘤菌菌株對(duì)于植物的生長(zhǎng)影響差異較大。在3個(gè)供試菌株中，菌株HBU037001處理的種子出苗率最高，而菌株HBU037002提高幼苗的干質(zhì)量幅度最大。已有研究[17]表明，根瘤菌的施用可以提高植物種子的萌發(fā)率，這對(duì)于植物在干旱環(huán)境中定植非常重要。因此，小葉錦雞兒的種植需要接種根瘤菌菌劑以提高其對(duì)干旱的抗性。因此，在今后的研究中，應(yīng)多篩選不同的根瘤菌菌株進(jìn)行研究，將不同菌株的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，對(duì)其特性研究，以選擇表現(xiàn)最優(yōu)的根瘤菌菌株制作菌劑，在生產(chǎn)上進(jìn)行應(yīng)用。

地木耳提取液處理對(duì)植物的干質(zhì)量影響較顯著，但根瘤菌菌劑與地木耳提取液的聯(lián)合處理(地木耳提取液1/10原液+菌劑HBU037001)為所有處理中提高植物干質(zhì)量最高者，這可能與兩者對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的累加作用有關(guān)。地木耳葉面噴施可以使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)從葉面輸送，促進(jìn)植物快速吸收地木耳提取液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而根瘤菌與植物形成的根瘤能利用空氣中的游離氮合成氨，促進(jìn)植物根際發(fā)育，使生物量增加。根據(jù)盛家榮等[18-19]的研究結(jié)果，地木耳提取物中起促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用的物質(zhì)主要是多糖，而在根瘤菌與豆科植物的識(shí)別機(jī)制當(dāng)中，根瘤菌表面多糖是植物與根瘤菌互作的必需物質(zhì)[20]，所以地木耳也間接地影響著根瘤菌的活動(dòng)；此外根瘤菌除了固氮活性外還可以活化土壤中的微生物群落，為植物提供磷、鉀等其他營(yíng)養(yǎng)及多種微量元素[21-23]，并可有效影響土壤呼吸速率[24]。

本研究證實(shí)這兩種微生物制劑對(duì)小葉錦雞兒的種植具有應(yīng)用價(jià)值，這兩種微生物制劑成本低，制作簡(jiǎn)易、無(wú)污染，是制作生物肥料的理想材料。今后將進(jìn)一步篩選更多的高效固氮根瘤菌菌株，并選擇人工培育的地木耳作為材料進(jìn)行研究，從而對(duì)這兩種微生物制劑進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)，減少化肥使用并節(jié)約國(guó)家資源[25]，為我國(guó)"退耕還林"、貧瘠土壤植樹(shù)造林、以及在干旱草原和荒漠草原植被恢復(fù)服務(wù)。

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