，，

(解放軍總醫(yī)院中醫(yī)研究所，北京 100853)

重組免疫毒素治療腫瘤的基本原理是尋找一種對腫瘤細胞有專一行親和能力的“生物導(dǎo)彈”，近年來利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了不同用途的免疫毒素[1-2]。研究表明，免疫毒素分子量更小、更易滲透至腫瘤組織、不容易產(chǎn)生抗體，但機體對毒素蛋白部分仍會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有人認為短期大量用藥會減少這一毒副作用。此外，腫瘤細胞表面存在的特異性靶抗原是導(dǎo)向治療的前提，在體內(nèi)具有靶向性，更易于與腫瘤細胞結(jié)合，對正常細胞的毒副作用很小，有很高的抑瘤率。在我國肝癌的發(fā)病率很高，長期以來一直缺乏十分有效的治療方法，應(yīng)用免疫毒素治療肝癌不失為一種有益的嘗試。本實驗室已成功地制備了新型免疫毒素EGF-TCSredlk,本實驗以荷人肝癌裸鼠為模型，觀察其在體內(nèi)對荷瘤小鼠的抑瘤效果，為腫瘤的治療提供了一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 重組免疫毒素EGF-TCSredlk由本實驗室制備、保存;RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；新生牛血清購自杭州四季青生物制品公司;DAB顯色劑、vWA兔多抗購自Dako公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞株及培養(yǎng) 肝癌BEL-7402細胞株購自北京協(xié)和藥物研究所，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代，采取貼壁細胞培養(yǎng)法，在5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)。

1.3 實驗動物 裸鼠20只，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半。購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。在清潔級實驗動物飼養(yǎng)中心內(nèi)飼養(yǎng)。

1.4 荷肝癌裸鼠動物模型的建立 體外培養(yǎng)生長活躍的肝癌BEL-7402細胞經(jīng)胰酶消化、收集并離心，用PBS配成1×107/mL單細胞懸液，分別以0.2 mL/只的劑量接種于飼養(yǎng)的裸鼠右腋皮下。約5 d左右即可見腫瘤生長。待腫瘤長至0.3 cm×0.3 cm時開始實驗。

1.5 分組及給藥 將20只小鼠隨機分成4組，對照組和治療組，每組5只，經(jīng)尾靜脈給予治療組注射不同劑量的免疫毒素EGF-TCSredlk，治療Ⅰ組、治療Ⅱ組和治療Ⅲ組劑量分別為25、50和100 μg/kg，對照組給予注射相同體積的生理鹽水。每日1次，連續(xù)7 d。

1.6 小鼠體內(nèi)抑瘤實驗 停藥1 d后處死小鼠，剝離瘤體，稱瘤重,計算抑瘤率。腫瘤抑制率按以下公式計算：腫瘤抑制率=[(對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100%。

1.7 腫瘤的病理變化觀察 按EnVisionTM試劑盒(丹麥DAKO基因公司)說明操作如下:1)石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次,每次3 min。2)對組織抗原進行高壓修復(fù)。3)每張切片加50 μL 3%過氧化氫阻斷溶液(試劑A)，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。4)除去PBS液，每張切片加50 μL正常非免疫動物血清(試劑B)，室溫下孵育10 min。5)除去血清，每張切片加50 μL第一抗體,4 ℃過夜。6)PBS沖洗3次，每次3～5 min。除去PBS液，每張切片加50 μL生物素標記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育30 min。PBS沖洗3次，每次3 min。7)除去PBS液，每張切片加50 μL鏈霉菌抗生素-過氧化氫酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。8)除去PBS液，每張切片加100 μL新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液，顯微鏡下觀察3～10 min。9)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染,氨水返籃。10)切片常規(guī)梯度乙醇(70%、80%、90%乙醇5 min各1次，95%乙醇5 min 2次，100%乙醇5 min 3次)脫水之后,二甲苯透明，50%中性樹膠封片。一抗工作濃度：vWA抗體(1∶200)，微波爐中進行抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。電鏡觀察組織結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

2.1 EGF-TCSredlk對荷人肝癌小鼠體內(nèi)抑瘤實驗結(jié)果 模型組平均瘤重(6.04±1.06)g，治療Ⅰ組平均瘤重(3.90±0.32)g，治療Ⅱ組平均瘤重(2.75±0.32)g，治療Ⅲ組平均瘤重(1.48±0.21)g，(Welch=82.617，P=0.000)，組間比較采用Tambane’s T2法，3組分別與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。3組抑瘤率分別為35.4%、54.5%、及75.5%。

2.2 腫瘤組織病理變化 成瘤組織經(jīng)HE病理切片示，瘤細胞彌漫浸潤成分單一，大小形態(tài)一致，瘤細胞呈圓形或卵圓形，細胞核卵圓形或不規(guī)則形，核仁明顯較大，核分離相多見，胞漿少或中等量。治療各組較對照組有更多的腫瘤壞死區(qū)(見圖1)。

3 討論

本實驗在體外培養(yǎng)生長活躍的肝癌BEL-7402細胞經(jīng)胰酶消化、收集并離心，用PBS配成1×107/mL的單細胞懸液，分別以0.2 mL/只的劑量接種于飼養(yǎng)的20只裸鼠右腋皮下，約5 d左右均見腫瘤生長，成功建立了肝癌移植瘤動物模型。在實驗中選用EGF-TCSredlk25、50、100 μg/kg 3種劑量和同等體積生理鹽水對荷人肝癌裸小鼠進行尾靜脈注射給藥體內(nèi)試驗。從瘤重和抑癌率兩方面對EGF-TCSredlk抑癌作用進行評估。在瘤重方面，EGF-TCSredlk與模型組對抑制裸鼠實體瘤生長有顯著性差異(P=0.000)。25 μg/kg EGF-TCSredlk治療組與模型組對抑制裸鼠實體瘤的生長沒有差異,50、100 μg/kg EGF-TCSredlk治療組與模型組對抑制裸鼠實體瘤的生長差異有統(tǒng)計學(xué)意義

A

B

C

D

(P<0.05)，瘤重減輕程度與劑量相關(guān)。低、中、高劑量組的抑制率分別為35.4%、54.5%及75.5%。按國家藥物試驗標準藥物的腫瘤抑制率>30%時,視為有效。本實驗EGF-TCSredlk劑量為25、50、100 μg/kg時抑瘤率均>30%,表明免疫毒素EGF-TCSredlk具有良好的體內(nèi)抑瘤作用。而其他的以EGFR為靶點的藥物，如EGFR單抗，治療劑量為10 mg/kg，是EGF-TCSredlk的200倍，并且沒有明顯的抑瘤率，只能用小鼠的生存時間來說明藥效[4-7]；腫瘤學(xué)病理研究[8]表明，如果腫瘤周圍沒有新生血管的生長、癌細胞生長及增殖在達到數(shù)微米體積時就會自身消亡。抗血管生成的目的在于損壞現(xiàn)有的腫瘤血管，阻止腫瘤的生長，抑制新的腫瘤血管形成。腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示EGF-TCSredlk可以明顯的抑制腫瘤血管的形成,高劑量組腫瘤組織未有可見血管，中低劑量組腫瘤組織血管明顯少于模型組，其抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的途徑可能是通過抑制腫瘤血管生長來抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移[8]。為腫瘤的治療提供一條新的思路。

[1]Wang L,Liu B,Schmidt M,et al.Antitumor effect of an HER2specific antibody-toxin fusion protein on human p rostate cancer cells[J].Prostate,2001,47:21-28.

[2]李詠梅,楊海文,羅仁,等.EGF-Linker-TCS融合蛋白誘導(dǎo)肝癌BEL-7402細胞凋亡[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2007,7(1):34.

[3]Fay PJ,Kawai Y.Propolypeptide of von Willebrand factor circulates in blood and is identical to von Willebrand antigen II[J].Science,1986,232:995-998.

[4]Morelli MP.Anti-tumor activity of the combination of cetuximab,an anti-EGFR blocking monoclonal antibody and ZD6474,an inhibitor of VEGFR and EGFR tyrosine kinases[J].Cell Phsiol,2006,208(20):344-355.

[5]Tonra JR,Deevi DS.Synergistic antitumor effects of combined epidermal growth factor receptor and vascular endothelial growth factor receptor targeted therapy[J].Clin Cancer Res,2006,12(4):2197-207.

[6]Saba NF,Khuri FR,Shin DM.Targeting the epidermal growth factor receptor.Trials in head and neck and lung cancer[J].Oncology,2006,20(2):153-161.

[7]Cengel KA,Hahn SM,Glatstein E.C-25 and PDT combination therapy for ovarian cancer[J].J Natl Cancer Inst,2005,97(20):1488-1489.

[8]Lieken S.The role of growth factors,angiogenic enzymes and apoptosis in neovascularization and tumor growth-collected publications[J].Verh K Acad Geneeskd Belg,2002,64(3):197-224.