李秋麗，包滿珠，王文恩

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

狗牙根(Cynodondactylon)是典型的暖季型草坪草之一，常在冬季不耐寒而枯黃。因此，低溫是限制其推廣應(yīng)用的主要因素[1-2]。近年來(lái)，已有不少有關(guān)狗牙根耐寒性的研究報(bào)道，主要對(duì)人工低溫脅迫下狗牙根的生理生化指標(biāo)進(jìn)行比較研究，并取得了一定的進(jìn)展[3-5]。本研究以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)通過(guò)輻射誘變選育的狗牙根新品系‘矮敗狗牙根’和田間篩選的優(yōu)良狗牙根無(wú)性系‘HN019’為對(duì)象，與目前草坪工程中廣泛應(yīng)用的‘天堂419’和‘公主’作比較，在露地栽培條件下的自然降溫過(guò)程中對(duì)其抗寒性進(jìn)行分析和比較，從各品種(系)的相關(guān)生理指標(biāo)對(duì)露地栽培下自然降溫過(guò)程中的變化來(lái)評(píng)價(jià)其耐寒性，以期篩選出耐寒性較好的品種(系)，為抗寒性暖季型草坪草的選育工作提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 研究對(duì)象是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)通過(guò)60Co-γ射線輻射誘變選育出的‘矮敗狗牙根’和田間篩選的優(yōu)良狗牙根無(wú)性系‘HN019’，與目前草坪工程中廣泛應(yīng)用的狗牙根品種‘天堂419’(Tifway)和‘公主’(Princess)作比較。4種材料均種植在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地草坪品種圃。

1.2試驗(yàn)方法 2009年10-12月，記錄每天的氣溫變化(圖1)。試驗(yàn)期間溫度整體呈下降趨勢(shì)，其中10月30日的溫度驟然升高，當(dāng)天的最低溫度為19℃；11月3日的溫度驟然降低，最低溫度為3℃；11月3日以后，最低溫度均在12℃以下，其中12月5日的最低溫度為1℃。試驗(yàn)期間，每隔10 d從品種圃隨機(jī)剪取4個(gè)狗牙根品種的嫩葉，分別對(duì)各品種葉片的電導(dǎo)率值、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Fpro)含量、可溶性糖(WSS)含量、可溶性蛋白(SP)含量、葉綠素(Chl)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性進(jìn)行測(cè)定，3次重復(fù)。電導(dǎo)率測(cè)定采用電導(dǎo)法[6]，MDA含量采用硫代巴比妥酸法[7]，F(xiàn)pro含量采用酸性茚三酮法[7]，WSS含量采用蒽酮比色法[7]，SP含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[7]，Chl含量采用95%乙醇熱浸法[8]，SOD活性采用SOD試劑盒[7](南京建成生物工程研究所生產(chǎn))。

1.3模糊隸屬函數(shù)法 為了全面利用各指標(biāo)對(duì)植物的抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)各指標(biāo)測(cè)定值進(jìn)行定量轉(zhuǎn)換[8]。

如果指標(biāo)與抗寒性呈正相關(guān)：

如果指標(biāo)與抗寒性呈負(fù)相關(guān)：

式中，Zij為i品種j指標(biāo)的抗寒性隸屬函數(shù)值，Xij為i品種j指標(biāo)的測(cè)定值，Ximax和Ximin為各品種中指標(biāo)的最大和最小測(cè)定值。

將植物各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值累加起來(lái)，求其平均值，隸屬函數(shù)值越大，該品種的抗寒性就越強(qiáng)。

圖1 試驗(yàn)期間日均溫變化

1.4數(shù)據(jù)分析 用Excel 2003和SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，用Excel 2003制圖，采用模糊隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)出各品種(系)的耐寒性強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1電導(dǎo)率的變化 在自然降溫過(guò)程中4個(gè)狗牙根品種(系)的電導(dǎo)率變化比較一致，呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)(圖2)。在降溫前期10月至11月初，電導(dǎo)率上升較緩慢，11月15日的電導(dǎo)率值增幅變大，其中‘公主’的電導(dǎo)率值增幅最大，達(dá)106.82%，‘矮敗狗牙根’、‘HN019’和‘天堂419’的增幅分別為84.29%、61.06%和67.36%。11月25日電導(dǎo)率值有所下降，在12月15日各品種(系)的電導(dǎo)率值達(dá)最高峰，‘公主’的峰值最大，為30.13%，‘矮敗狗牙根’的峰值較小，為25.16%(圖2)。通過(guò)對(duì)各品種(系)的電導(dǎo)率均值進(jìn)行差異顯著性比較發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)自然降溫過(guò)程中，‘公主’和‘天堂419’的電導(dǎo)率均值顯著高于‘HN019’和‘矮敗狗牙根’(P<0.05)， 其中‘矮敗狗牙根’的電導(dǎo)率值顯著低于其他品種(系)(表1)。

圖2 露地栽培下狗牙根相對(duì)電導(dǎo)率的變化

表1 狗牙根品種(系)間生理指標(biāo)比較

2.2丙二醛含量的變化 在自然降溫過(guò)程中，4個(gè)狗牙根品種(系)的MDA含量總體呈緩慢上升的趨勢(shì)(圖3)。在降溫初期10月15日-11月4日，MDA含量上升緩慢，11月15日時(shí)MDA含量增幅變大，‘天堂419’和‘矮敗狗牙根’的增幅為47.03%和40.73%，大于‘公主’和‘HN019’的增幅。在11月15日之后，MDA含量出現(xiàn)小的下降然后平緩上升，于12月15日達(dá)到最高峰(圖3)。通過(guò)對(duì)各品種(系)的MDA均值進(jìn)行差異顯著性比較發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)自然降溫過(guò)程中，‘天堂419’、‘矮敗狗牙根’、 ‘公主’三者之間的MDA含量差異不顯著(P>0.05)，‘天堂419’和‘矮敗狗牙根’的MDA含量顯著高于‘HN019’(P<0.05)(表1)。

圖3 露地栽培下狗牙根丙二醛含量的變化

2.3脯氨酸含量的變化 在自然降溫過(guò)程中，4個(gè)狗牙根品種(系)的Fpro含量變化呈先上升又緩慢下降的趨勢(shì)(圖4)。在降溫前期10月-11月初，各品種(系)的Fpro含量增幅較大，11月4日-11月15日Fpro含量變化平緩，11月15日各品種(系)的Fpro含量達(dá)到最大值，其中‘公主’的峰值最大，為92.56μg/g, ‘天堂419’、‘矮敗狗牙根’和‘HN019’的峰值分別為90.85、90.11和86.12 μg/g(圖4)。通過(guò)對(duì)各品種(系)的Fpro均值進(jìn)行差異顯著性比較發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)自然降溫過(guò)程中，‘公主’的Fpro含量顯著高于其他品種(P<0.05)，‘HN019’ 的Fpro含量顯著低于其他品種(P<0.05)，‘天堂419’和‘矮敗狗牙根’的的Fpro含量差異不顯著(P>0.05)(表1)。

圖4 露地栽培下狗牙根脯氨酸含量的變化

2.4可溶性糖含量的變化 在自然降溫過(guò)程中，4個(gè)狗牙根品種(系)的WSS含量呈現(xiàn)出先緩慢升高又下降再升高再下降的趨勢(shì)(圖5)。降溫初期各品種(系)的WSS含量增長(zhǎng)較慢，‘天堂419’和‘HN019’的WSS含量在11月4日達(dá)到第1個(gè)峰值，分別為15.48和17.16 mg/g，‘矮敗狗牙根’和‘公主’在11月15日達(dá)到第1個(gè)峰值，分別為21.10和18.85 mg/g。隨后WSS含量有一定程度的下降，各品種(系)的WSS含量均在12月5日達(dá)到了第2個(gè)峰值，隨后逐漸下降。通過(guò)對(duì)各品種(系)的WSS均值進(jìn)行差異顯著性比較發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)自然降溫過(guò)程中，‘矮敗狗牙根’和‘公主’的WSS含量差異不顯著(P>0.05)，‘天堂419’和‘HN019’的WSS含量差異不顯著(P>0.05)，‘矮敗狗牙根’和‘公主’的WSS含量極顯著高于‘天堂419’和‘HN019’的WSS含量(P<0.01)(表1)。

圖5 露地栽培下狗牙根可溶性糖含量的變化

2.5可溶性蛋白含量的變化 在自然降溫過(guò)程中，4個(gè)狗牙根品種(系)的SP含量變化呈現(xiàn)出先迅速升高又迅速下降再緩慢升高的趨勢(shì)(圖6)。4個(gè)狗牙根品種(系)的SP含量均在11月4日時(shí)迅速升高并且到達(dá)峰值，‘矮敗狗牙根’和‘天堂419’的峰值較大，分別為23.50和23.28 mg/g。11月4日-11月15日各品種(系)的SP含量迅速下降，11月15日-12月15日的降溫期間SP含量又逐漸升高(圖6)。通過(guò)對(duì)各品種(系)的SP均值進(jìn)行差異顯著性比較發(fā)現(xiàn)，‘矮敗狗牙根’和‘天堂419’ 的SP含量顯著高于 ‘HN019’和‘公主’的SP含量(P<0.05)(表1)。

圖6 露地栽培下狗牙根可溶性蛋白含量的變化

2.6葉綠素含量的變化 在自然降溫過(guò)程中，4個(gè)狗牙根品種(系)的Chl含量變化表現(xiàn)一致，總體呈現(xiàn)出曲折下降的趨勢(shì)(圖7)。在降溫初期10月15日-11月4日，各品種(系)的Chl含量先上升后下降，11月15日隨著溫度的回升Chl含量也有一定的增加，11月15日之后隨著低溫的加劇Chl含量呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)?？梢钥闯?，在整個(gè)自然降溫過(guò)程中，‘天堂419’的Chl含量相對(duì)處于較高水平，‘矮敗狗牙根’的Chl含量一直較低，‘HN019’和‘公主’的Chl含量處于中間水平(圖7)。通過(guò)對(duì)各品種(系)的Chl均值進(jìn)行差異顯著性比較發(fā)現(xiàn)，‘天堂419’和‘公主’的Chl含量高于‘HN019’和‘矮敗狗牙根’，但前兩者與‘HN019’差異不顯著(P>0.05)，與‘矮敗狗牙根’差異顯著(P<0.05)(表1)。

圖7 露地栽培下狗牙根葉綠素含量的變化

2.7超氧化物歧化酶活性的變化 在自然降溫的過(guò)程中，4個(gè)狗牙根品種(系)的SOD活性變化呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)(圖8)。10月15日-11月4日的降溫過(guò)程中，各品種(系)的SOD活性急速上升，11月4日-11月15日隨著溫度的回升SOD活性又急速下降，隨后SOD活性隨著低溫的加劇而緩慢下降。各品種(系)的SOD活性于11月4日達(dá)到最高峰值，‘矮敗狗牙根’和‘天堂419’的峰值最大，分別為51.86和51.08 U/g，‘公主’和‘HN019’的峰值分別為38.11和39.34 U/g。可以看出，在整個(gè)自然降溫過(guò)程中‘矮敗狗牙根’的SOD活性一直處于較高水平，11月4日之后‘HN019’的SOD活性也隨著低溫加劇而保持較高水平，‘天堂419’(除11月4日外)和‘公主’的SOD活性在整個(gè)降溫過(guò)程中相對(duì)較低(圖8)。通過(guò)對(duì)各品種(系)的SOD活性均值進(jìn)行差異顯著性比較發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)自然降溫過(guò)程中，‘矮敗狗牙根’和‘HN019’的SOD活性顯著高于‘天堂419’和‘公主’(P<0.05)(表1)。

圖8 露地栽培下狗牙根SOD活性的變化

2.8模糊隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià) ‘矮敗狗牙根’的隸屬度平均值最大，為0.645 7，其次為‘公主’和‘天堂419’，隸屬度分別為0.477 8和0.407 4，‘HN019’的隸屬度較小，為0.379 2(表2)。由此可以得出4個(gè)狗牙根品種(系)的耐寒性強(qiáng)弱順序?yàn)椤珨」费栏?‘公主’>‘天堂419’>‘HN019’。

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境發(fā)生物質(zhì)交換、能量轉(zhuǎn)換、信號(hào)傳遞等生命活動(dòng)的重要場(chǎng)所和媒介，也是細(xì)胞感受環(huán)境脅迫最敏感的部位[9]。植物受到低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜透性會(huì)有不同程度增大，電解質(zhì)會(huì)不同程度外滲，導(dǎo)致電導(dǎo)率升高[10]。丙二醛是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物之一，能與細(xì)胞內(nèi)部各種成分發(fā)生強(qiáng)烈的反應(yīng)而引起酶和膜的嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和生理完整性的破壞，是膜系統(tǒng)受傷害的重要指標(biāo)[11-12]。

表2 露地栽培條件下各狗牙根材料耐寒性綜合評(píng)價(jià)

本研究通過(guò)對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)4個(gè)狗牙根品種(系)的電導(dǎo)率隨著溫度的降低整體呈現(xiàn)出增大趨勢(shì)，丙二醛含量隨著溫度的降低總體呈現(xiàn)上升后下降趨勢(shì)，耐寒性強(qiáng)的的品種(系)電導(dǎo)率較小，丙二醛含量較低，表明其細(xì)胞受損程度較小。在11月15日溫度回升期，各狗牙根品種電導(dǎo)率出現(xiàn)緩慢下降，可能是溫度回升使植株對(duì)低溫有了一定的適應(yīng)。但隨著12月低溫的到來(lái)，電導(dǎo)率值出現(xiàn)了迅速增高的現(xiàn)象，表明此時(shí)植物隨著低溫的加強(qiáng)受到的傷害加劇。丙二醛含量出現(xiàn)小的下降然后平緩上升，這與電導(dǎo)率表現(xiàn)一致，說(shuō)明植物體內(nèi)丙二醛對(duì)溫度的變化反應(yīng)敏感，并隨著溫度的下降含量逐漸增高。

一般認(rèn)為脯氨酸在植物抵抗低溫脅迫時(shí)起到平衡細(xì)胞代謝的作用，以保持細(xì)胞環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，其含量的增加有利于提高抗寒性[13]。低溫脅迫下脯氨酸含量逐漸增加，可以降低細(xì)胞水勢(shì)，以此避免凍害的發(fā)生[14-15]?？扇苄蕴悄軌蛟黾蛹?xì)胞液濃度，降低冰點(diǎn)，并與水結(jié)合，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)束縛水含量增高，增強(qiáng)細(xì)胞液的流動(dòng)性，原生質(zhì)粘性增強(qiáng)，細(xì)胞耐結(jié)冰脫水能力和耐凍性增強(qiáng)[16]?？扇苄蕴呛吭礁?，植物組織細(xì)胞液濃度也越高，植物耐寒能力越強(qiáng)[17]。本研究表明，脯氨酸含量隨著低溫的到來(lái)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，可溶性糖含量隨著低溫的到來(lái)呈現(xiàn)整體上升又下降的趨勢(shì)，耐寒性強(qiáng)的品種，脯氨酸和可溶性糖含量較大。11月4日-11月15日的溫度回升期，各品種(系)的可溶性蛋白含量迅速下降，11月15日-12月15日的降溫期間可溶性蛋白含量又開(kāi)始升高，表明植物體內(nèi)可溶性蛋白對(duì)溫度的變化反應(yīng)敏感。各品種(系)的可溶性蛋白含量在11月4日和12月15日的低溫期出現(xiàn)兩次峰值，說(shuō)明植物體內(nèi)可溶性蛋白隨著溫度的變化做出了適應(yīng)。

低溫對(duì)葉綠素影響有兩個(gè)方面，一是葉綠素的生物合成過(guò)程絕大部分有酶參與，低溫影響酶的活性，進(jìn)而影響葉綠素的合成；二是低溫作用于植物，使植物本身形成水分逆境，因組織缺水引起氣孔關(guān)閉，葉綠體受傷，與光合作用有關(guān)的酶失活或變性[18-19]。因此在植物耐寒生理研究中，葉綠素含量常作為反映低溫脅迫對(duì)植物造成傷害程度的生理指標(biāo)。本研究表明，在自然降溫過(guò)程中，葉綠素含量隨著溫度的降低總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，耐寒性強(qiáng)的品種，葉綠素含量較高。

超氧化物歧化酶是防御細(xì)胞膜系統(tǒng)受活性氧損害的保護(hù)酶之一[20]，能以超氧陰離子為基質(zhì)進(jìn)行歧化反應(yīng)，進(jìn)而清除植物組織和細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子自由基，同時(shí)產(chǎn)生歧化物H2O2，從而減緩超氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜的傷害。低溫下植物體內(nèi)SOD酶活性的變化與其抗寒性密切相關(guān)，超氧化物歧化酶是植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，是酶促清除系統(tǒng)中的核心酶[21-22]。本研究表明，超氧化物歧化酶活性隨著溫度的降低呈先上升又下降的趨勢(shì)，耐寒性強(qiáng)的品種，超氧化物歧化酶活性相對(duì)較高。在降溫初期各品種(系)的超氧化物歧化酶活性急速上升，溫度回升期又急速下降，隨后超氧化物歧化酶活性隨著低溫的加劇而緩慢下降，表明植物內(nèi)超氧化物歧化酶對(duì)低溫反應(yīng)敏感，各品種(系)在11月4日達(dá)到最高峰，表明11月4日的低溫已是植物體內(nèi)超氧化物歧化酶能適應(yīng)的極限溫度。

在整個(gè)自然降溫過(guò)程中，4個(gè)狗牙根品種(系)的生理生化指標(biāo)變化趨勢(shì)比較一致，通過(guò)差異顯著性分析可以看出品種上各生理指標(biāo)存在顯著差異。綜合來(lái)看，‘矮敗狗牙根’的電導(dǎo)率值最小，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和超氧化物歧化酶活性最大，‘公主’的脯氨酸、可溶性糖和葉綠素含量較大，‘天堂419’的丙二醛含量和葉綠素含量較大?！瓾N019’的電導(dǎo)率值較大，脯氨酸和可溶性糖含量較小。在時(shí)間上可以看出各品種(系)在12月受低溫傷害最嚴(yán)重。通過(guò)模糊隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)得出，4個(gè)狗牙根品種(系)的耐寒性強(qiáng)弱順序?yàn)椤珨」费栏?‘公主’>‘天堂419’>‘HN019’。

[1] 鄭玉紅,劉建秀,陳樹(shù)元，等.中國(guó)狗牙根[Cynodondactylon(L.)Pers.]耐寒性及其變化規(guī)律[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2002，11(2)：48-52.

[2] 劉玲瓏,吳彥奇.狗牙根種質(zhì)資源及抗寒性研究進(jìn)展[J].中國(guó)草地，2000(6)：45-50.

[3] 劉志雄,周高峰,廖啟榮,等.低溫脅迫對(duì)幾個(gè)狗牙根品種生理生化特征的影響[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,13(4):23-25.

[4] 張偉鋒,陳平,姬承東.廣州地區(qū)幾種草坪草低溫脅迫效應(yīng)研究[J].草業(yè)科學(xué),2006,23(8):85-88.

[5] 代會(huì)平,楊知建,胡勇.狗牙根抗寒性研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2007,24(11):87-91.

[6] 蕭浪濤,王三根．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006．

[7] 李合生．植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2005．

[8] 邵文鵬．幾種常綠闊葉植物抗寒性研究[D].青島：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

[9] Lyons J M.Chilling injury in plants[J].Annual Review of Plant Physiology,1973(24):445-448.

[10] 王洪春．植物抗逆性與生物膜結(jié)構(gòu)功能研究進(jìn)展[J].植物生理學(xué)通訊，1985(1)：60-66.

[11] 鄭小林，胡木林，羅曉瑩，等．假儉草低溫脅迫的傷害與適應(yīng)[J].草業(yè)科學(xué)，2002，19(7)：55-57.

[12] 張朝陽(yáng)，許桂芳．利用隸屬函數(shù)法對(duì)4種地被植物的耐熱性綜合評(píng)價(jià)[J].草業(yè)科學(xué)，2009，26(2)：57-60.

[13] Dunn J H,Nelson C J.Chemical changes occurring in three bermudagrass turf cultivars in relation to cold hardiness[J].Agronomy Journa1,1974(6):28-31.

[14] 龔明,劉友良,朱培仁．低溫下稻苗葉片中蛋白質(zhì)及游離脯氨酸的變化[J].植物生理學(xué)通訊，1989(4)：18-22.

[15] 陳杰忠,徐春香,梁立峰．低溫對(duì)香蕉葉片中蛋白質(zhì)及脯氨酸的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，20(3)：54-56.

[16] 宋海鵬，劉君，李秀玲，等.干旱脅迫對(duì)5種景天屬植物生理指標(biāo)的影響[J].草業(yè)科學(xué)，2010，27(1)：11-15.

[17] 何若韞．植物低溫逆境生理[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995:13-35.

[18] 劉兵,張世權(quán),郭家保．植物耐逆研究概況[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，12(8)：39-121.

[19] 杜秀敏,殷文漩．超氧化物歧化酶(SOD)研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2003，23(1)：48-51.

[20] 楊鑫光，傅華，牛得草．干旱脅迫下幼苗期霸王的生理響應(yīng)[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16(5)：107-112.

[21] 王齊，孫吉雄，安淵．水分脅迫對(duì)結(jié)縷草種群特征和生理特性的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(2)：33-38.

[22] 王靜,楊持．冷蒿耐寒生理特性的研究[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，33(6)：673-676.