韓永增，王 贊，高洪文

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)為豆科錦雞兒屬多年生飼用灌木，多分布于中國東北及內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西等地，蒙古、西伯利亞也有分布[1]。因其耐干旱、低溫，能抗風(fēng)沙，再生力強(qiáng)，耐瘠薄等特性而成為良好的飼用灌木和生態(tài)保護(hù)先鋒植物。微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)Simple sequence repeats(SSR)， 是一種基于DNA長度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)，具有共顯性、高度可重復(fù)性及多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳學(xué)、進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種、系譜分析和法醫(yī)鑒定的理想工具[2-7]。目前國外已經(jīng)應(yīng)用該技術(shù)對(duì)很多物種進(jìn)行了遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析研究[8-11]，國內(nèi)在牧草上也有部分應(yīng)用[12-13]，但在小葉錦雞兒上應(yīng)用SSR標(biāo)記的研究卻很少[14]。其主要原因就是缺少用于小葉錦雞兒SSR分子標(biāo)記的引物，而本研究所采用的引物為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室自行開發(fā)的SSR引物，并利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶濃度進(jìn)行五因素四水平優(yōu)化篩選，從而建立高效、穩(wěn)定的小葉錦雞兒SSR-PCR反應(yīng)體系，為SSR標(biāo)記在錦雞兒屬植物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析及分子育種等研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 供試材料為24份小葉錦雞兒種質(zhì)資源，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草種質(zhì)庫提供，1號(hào)為體系優(yōu)化模板，其他均為檢測模板(圖1)。

1.2方法

1.2.1DNA提取及檢測 DNA提取技術(shù)采用CTAB法從小葉錦雞兒種子中進(jìn)行提取[15]，用1%瓊脂糖電泳檢測其質(zhì)量，用UNICO UV-2000型分光光度計(jì)檢測其濃度，所有DNA樣品稀釋到50 ng/μL。

1.2.2反應(yīng)體系優(yōu)化 針對(duì)模板DNA、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶等5種影響因素進(jìn)行L16(45)正交實(shí)驗(yàn)(表1和表2)。引物為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室開發(fā)的“S1-25”(待發(fā)表)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性45 s，65℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)的復(fù)性溫度遞減1℃；94℃變性45 s，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存[16]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺分離及銀染檢測[17]。

1.2.3優(yōu)化體系的最終確定 在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上又做了Mg2+和Taq DNA聚合酶的四水平完全正交試驗(yàn)，以確定最佳的反應(yīng)體系，其設(shè)計(jì)見表3和表4。結(jié)果用1%瓊脂糖電泳檢測。

圖1 小葉錦雞兒種子DNA電泳圖

表1 SSR-PCR體系的正交設(shè)計(jì)因素及水平

表2 SSR-PCR體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[L16(45)]

表3 Mg2+和Taq DNA 聚合酶的四水平

表4 Mg2+和Taq DNA聚合酶完全正交設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1DNA提取質(zhì)量 用CTAB法提取的小葉錦雞兒基因組DNA完整，無降解，且無RNA殘留。用紫外分光光度計(jì)檢測，OD260/OD280值符合SSR分子標(biāo)記的要求(圖1)。

2.2SSR-PCR正交設(shè)計(jì)結(jié)果及分析 根據(jù)SSR-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果(圖2)可以清晰地看出，這16個(gè)組合中，7、8兩組條帶清晰明亮且沒有雜帶，而這兩組只有DNA的量是相同的，所以要確定其他影響因素的量還要經(jīng)過進(jìn)一步的分析。依據(jù)前人研究[18]可知，引物與模板結(jié)合后在Taq酶作用下進(jìn)行延伸，Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，受Mg2+濃度的影響，而Mg2+又受dNTP的拮抗作用。所以，現(xiàn)在只需將dNTP與引物的量固定，設(shè)計(jì)Mg2+與Taq酶的完全正交試驗(yàn)即可得到最佳的優(yōu)化體系。出于成本考慮，本試驗(yàn)選擇dNTP水平較低的第8組合作為基礎(chǔ)。從Mg2+與Taq酶的完全正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出(圖3)，Taq酶的量對(duì)體系影響不顯著，而Mg2+的量對(duì)體系影響十分顯著。因表4第15組合與表2第8組合完全相同，所以可以確定條帶最亮的第12組合為最佳體系，即：40 ng模板DNA，3 mmol/L Mg2+，300 μmol/L dNTP，0.6 μmol/L引物，1 U DNA聚合酶，1×Buffer，加dd H2O至25 μL。

圖2 SSR-PCR正交設(shè)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果

圖3 Mg2+和Taq DNA聚合酶完全正交設(shè)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果

2.3優(yōu)化體系應(yīng)用 利用優(yōu)化的PCR體系對(duì)其余種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增，條帶清晰明亮且特異性強(qiáng)(圖4)，證明此體系具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，同時(shí)也表明小葉錦雞兒種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性，可以應(yīng)用該優(yōu)化體系對(duì)其進(jìn)行多樣性分析研究。應(yīng)用本優(yōu)化體系對(duì)自行開發(fā)的其他SSR引物進(jìn)行PCR篩選，共得到有效擴(kuò)增引物37對(duì)，根據(jù)其多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)可知，多態(tài)性引物21對(duì)(56.8%)(其部分結(jié)果見圖5)，證明此體系也具有較好的廣泛應(yīng)用性。

圖4 優(yōu)化體系對(duì)所有小葉錦雞兒種質(zhì)資源的擴(kuò)增結(jié)果

圖5 引物S1-13對(duì)所有小葉錦雞兒種質(zhì)資源的擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展完善，SSR標(biāo)記也因具有很多優(yōu)良特性而被廣泛應(yīng)用，尤其是在優(yōu)良牧草上的應(yīng)用將更加深入。因影響SSR-PCR的因素很多，且各個(gè)因素相互影響[18]，所以應(yīng)用正交設(shè)計(jì)這一實(shí)用工具將大大提高工作效率。通過本研究優(yōu)化出的擴(kuò)增體系表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和廣泛性，可為今后的科研工作提供參考。

本研究表明，Mg2+的濃度對(duì)SSR-PCR體系的影響十分明顯，這與前人的結(jié)論一致[19]，因此在本研究中參照張麗芳等[20]SSR優(yōu)化方法再設(shè)計(jì)一組二因素四水平完全隨機(jī)試驗(yàn)，逐個(gè)優(yōu)化其他反應(yīng)成分以確定最佳的反應(yīng)組合。本次SSR-PCR體系的優(yōu)化從更多方面進(jìn)行開展，能為今后的科研工作提供幫助。但還有些不足，如PCR儀的不同對(duì)體系的影響，聚丙烯酰胺凝膠的濃度對(duì)產(chǎn)物的分離效率及不同的點(diǎn)樣量對(duì)分離效果的影響等問題還有待進(jìn)一步研究。

本研究所選的PCR程序?yàn)镚harghani等[16]的程序，而這一類型的程序在不同的物種當(dāng)中已有廣泛的應(yīng)用，如韓香婷[21]、曹永國[22]、Tang等[23]分別在大白菜(Brassicapekinensis)、玉米(Zeamays)及資源冷杉(Abiesziyuanensis)中都應(yīng)用此類程序完成了SSR分子標(biāo)記工作。該程序的優(yōu)點(diǎn)是不改變?nèi)魏螀?shù)即可將不同引物進(jìn)行擴(kuò)增，大大節(jié)省了退火溫度的檢測時(shí)間和成本。該類程序可為今后的SSR標(biāo)記工作提供幫助。

依據(jù)優(yōu)化的PCR體系對(duì)所設(shè)計(jì)的SSR引物進(jìn)行篩選，結(jié)果有5對(duì)(11.63%)得到擴(kuò)增，但沒有一致性，也與目的片段相差很大，有1對(duì)(2.32%)沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，其原因可能為設(shè)計(jì)引物時(shí)所選用的序列為基因突變的片段，另外也有可能是測序過程中的堿基錯(cuò)誤影響了引物設(shè)計(jì)，進(jìn)而影響了PCR擴(kuò)增。本研究共得到多態(tài)性引物21對(duì)，其余引物也可能存在多態(tài)性，只是因?yàn)橛糜跈z測的個(gè)體數(shù)較少而沒有表現(xiàn)出多態(tài)性，這些引物的多態(tài)性檢測將在今后的工作中進(jìn)行。

4 結(jié)論

1)采用正交設(shè)計(jì)和完全正交試驗(yàn)優(yōu)化了小葉錦雞兒SSR-PCR反應(yīng)體系，其最適的反應(yīng)體系為(25 μL)：40 ng模板DNA，3 mmol/L Mg2+，300 μmol/L dNTP，0.6 μmol/L引物，1 U Taq DNA聚合酶，1×Buffer。

2)利用上述優(yōu)化體系對(duì)小葉錦雞兒種質(zhì)資源進(jìn)行檢測，證明該體系具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性；應(yīng)用該體系對(duì)自行開發(fā)的SSR引物進(jìn)行篩選，得到有效擴(kuò)增引物37對(duì)，其中多態(tài)性引物21對(duì)，占56.8%，證明該體系具有廣泛的應(yīng)用性。

[1] 趙一之.小葉、中間和檸條三種錦雞兒的分布式樣及其生態(tài)適應(yīng)[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25(12)：3411-3414.

[2] 雷天剛，何永睿，吳鑫，等.柑橘栽培品種(系)DNA 指紋圖譜庫的構(gòu)建[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(8)：2852-2861.

[3] 王麗俠，程須珍，王素華，等.利用SSR 標(biāo)記分析小豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(8)：2661-2666.

[4] 段艷鳳，劉杰，卞春松，等.中國88個(gè)馬鈴薯審定品種SSR指紋圖譜構(gòu)建與遺傳多樣性分析[J].作物學(xué)報(bào)，2009，35(8)：1451-1457.

[5] 王軍.生物技術(shù)與葡萄遺傳育種[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(8)：2862-2874.

[6] 蔣益敏，李體琛，蒙成，等.利用SSR標(biāo)記鑒定玉米雜交種南校18號(hào)種子純度[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40(5)：464-467.

[7] 解新明，盧小良.SSR和ISSR標(biāo)記及其在牧草遺傳與育種研究中的應(yīng)用前景[J].草業(yè)科學(xué)，2005，22(2)：30-37.

[8] Cao Q J，Lu B R，Xia H，etal.Genetic diversity and origin of weedy rice (Oryzasativaf.spontanea) populations found in north-eastern China revealed by Simple Sequence Repeat (SSR) markers[J].Annals of Botany，2006，98：1241-1252.

[10] Matsumoto A，Uchida K，Taguchi Y，etal.Genetic diversity and structure of natural fragmentedChamaecyparisobtusapopulations as revealed by microsatellite markers [J].Journal of Plant Research，2010，123：689-699.

[11] Tsuda Y，Kimura M，Kato S，etal.Genetic structure ofCerasusjamasakura，a Japanese flowering cherry，revealed by nuclear SSRs：implications for conservation[J].Journal of Plant Research，2009，122：367-375.

[12] 孫建萍，袁慶華.利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記研究我國16份披堿草遺傳多樣性[J].草業(yè)科學(xué)，2006，23(8)：40-44.

[13] 謝文剛，張新全，馬嘯，等.中國西南區(qū)鴨茅種質(zhì)遺傳變異的SSR分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(4)：138-146.

[14] 郭強(qiáng)，時(shí)永杰，魏臻武，等.河西走廊14種錦雞兒遺傳多樣性SSR分析[J].草地學(xué)報(bào)，2008，16(3)：227-233.

[15] 徐博.內(nèi)蒙古東部野生小葉錦雞兒遺傳多樣性研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.

[16] Gharghani A，Zamani Z，Talaie A，etal.Genetic identity and relationships of Iranian apple (Malus×domesticaBorkh.) cultivars and landraces，wild Malus species and representative old apple cultivars based on simple sequence repeat (SSR) marker analysis[J].Genetic Resources and Crop Evolution，2009，56：829-842.

[17] 吳宗懷.紫花苜蓿、雜花苜蓿和黃花苜蓿SSR分子標(biāo)記分析[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[18] 王志勇，郭海林，劉建秀.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化狗牙根SSR-PCR 反應(yīng)體系[J].分子植物育種，2007，5(S1)：201-206.

[19] 張阿英.中國紫花苜蓿(MedicagosativaL.)地方品種SSR分析[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[20] 張麗芳，魏臻武，楊占花.蒺藜苜蓿SSR反應(yīng)體系優(yōu)化及在一年生苜蓿種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用[J].草地學(xué)報(bào)，2007，15(5)：429-436.

[21] 韓香婷.大白菜抗軟腐病性狀的SSR分子標(biāo)記分析[D].北京：首都師范大學(xué)，2006.

[22] 曹永國.SSR標(biāo)記在玉米雜種優(yōu)勢及遺傳圖譜中的應(yīng)用研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2000.

[23] Tang S Q，Dai W J，Li M S，etal. Genetic diversity of relictual and endangered plantAbiesziyuanensis(Pinaceae) revealed by AFLP and SSR markers[J].Genetica，2008，133:21-30.