邵榮姿，劉召紅，張儉儉

生物體衰老是一復(fù)雜的、具有不同器官和系統(tǒng)的數(shù)不清的一系列特定變化的過程。大量事實證明，人體衰老存在學(xué)習(xí)記憶減退和認知障礙。動物實驗研究也表明，衰老與認知功能障礙密切相關(guān)。D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致衰老模型，是較有代表性的癡呆動物模型。

丹參紅花提取物商品名丹紅注射液，是把中藥丹參、紅花按科學(xué)配方提取的復(fù)方制劑。中藥丹參的主要功效是活血化瘀，而紅花具有活血通絡(luò)、祛瘀鎮(zhèn)痛之功效，二者均為治療胸痹的常用藥。丹紅注射液能夠明顯緩解心絞痛癥狀，改善心肌缺血情況，且在臨床應(yīng)用治療過程中未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，為治療冠心病心絞痛之高效、安全的理想藥物[1]。本文介紹用D-gal致的衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶減退模型為研究對象，采用Y型迷宮和跳臺檢測學(xué)習(xí)記憶功能，同時測定超氧化物歧化酶 （SOD）和丙二醛（MDA）含量，探討丹參紅花提取物對D-gal致小鼠衰老模型學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)作用，為其進一步應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 丹參紅花提取物由由陜西步長集團提 供 ， 國 藥 準 字 號 Z20026866；SOD (批 號 ：20070119）、MDA（批號：20061203）檢測試劑盒均采用南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 儀器YLS-3T跳臺記錄儀 （山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）；Y型迷宮（江蘇省張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠）；2550型紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.1.3 動物 SPF級C57BL/6J小鼠60只，雌雄各半，4月齡，均由山東大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證編號：SCXK魯20030004。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥 C57BL/6J小鼠60只，隨機分為5組，每組12只，自由進食和飲水，經(jīng)過1周適應(yīng)期后給藥。分組給藥情況如下：正常對照組、模型對照組、丹參紅花提取物低劑量組（10 mg/kg·d）、丹參紅花提取物中劑量組（20 mg/kg·d）、丹參紅花提取物高劑量組（40 mg/kg·d）。其中，模型對照組和丹參紅花提取物組皮下注射D－gal（0.5 g/kg·d）后，丹參紅花提取物組每日灌服藥物，而正常對照組和模型對照組每日灌服等量生理鹽水，連續(xù)給藥8周，再進行實驗。

1.2.2 跳臺實驗 小鼠第1次受電擊后跳下平臺的時間(潛伏期)，此即學(xué)習(xí)能力測驗。24 h后重復(fù)試驗，此即記憶保持測驗（24 h潛伏期）。具體操作按儀器說明進行。

1.2.3 水迷宮實驗 小鼠第1次受電擊后逃到安全區(qū)的時間（潛伏期）。24 h后重復(fù)試驗，以此作為記憶保持試驗（24 h潛伏期），此即記憶能力。具體操作按儀器說明進行。

1.2.4 血漿、組織SOD、MDA活力測定 用乙醚麻醉小鼠后，從眼球取血，置于肝素化的試管中。將血液以1 500 r/min離心10 min，吸取上層血漿用于測定SOD及MDA含量。而后脫臼處死小鼠，取出腦、肝、腎臟以及后肢肌肉，用冰冷的生理鹽水沖洗后凍存于液氮中備用。SOD、MDA按試劑盒說明書測定。

2 結(jié) 果

2.1 丹參紅花提取物對小鼠體重的影響 與模型對照組相比，丹參紅花提取物對D-gal致衰老模型小鼠體重的影響無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 丹參紅花提取物對小鼠跳臺測試的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠跳臺測試錯誤次數(shù)明顯增多（P<0.01）；與模型對照組相比，丹參紅花提取物高、中劑量組能明顯降低D-gal致小鼠衰老模型的跳臺錯誤次數(shù)（P<0.05）；低劑量組也能不同程度地降低D-gal致小鼠衰老模型的跳臺錯誤次數(shù)，但無顯著性差異（P>0.05）。見表1。

2.3 丹參紅花提取物對小鼠迷宮測試的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠迷宮測試潛伏期明顯延長，迷宮測試錯誤次數(shù)明顯增多 （P<0.05）；與模型對照組相比，丹參紅花提取物高劑量組能明顯降低D-gal致小鼠衰老模型的迷宮測試潛伏期和錯誤次數(shù)（P<0.05，P<0.01），中、低劑量組均能不同程度地降低D-gal致小鼠衰老模型的迷宮測試潛伏期和迷宮測試錯誤次數(shù)，但無顯著性差異（P>0.05）。見表2。

2.4 丹參紅花提取物對氧化抗氧化指標的影響

與正常對照組比較，模型對照組小鼠血液、肝、腦、腎臟中，MDA含量顯著增高 （P<0.05），SOD活力顯著降低（P<0.05）；與模型對照組相比，丹參紅花提取物高劑量組MDA活力顯著提高 （P<0.05），SOD活力提高非常顯著（P<0.05，P<0.01）。與模型對照組相比，中、低劑量組MDA含量與SOD活性產(chǎn)生相同趨勢變化，但變化不顯著。見表3、4。

表1 小鼠跳臺實驗結(jié)果（±s）

表1 小鼠跳臺實驗結(jié)果（±s）

與模型對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

組 別 n正常對照組 12模型對照組 12丹參紅花提取物低劑量組（10 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物中劑量組（20 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物高劑量組（40 mg/kg·d） 12潛伏期（h） 錯誤次數(shù) 24 h潛伏期 24 h錯誤次數(shù)2.43±1.15 2.23±0.73# 205.25±60.88* 1.87±0.64*3.10±1.52 4.33±1.61 190.5±89.84 2.88±0.89 2.29±0.94 3.23±1.35 232.75±96.65 2.21±1.21 2.24±1.28 2.97±1.35* 160.00±78.37* 2.00±1.43 3.20±1.17 2.28±1.54# 151.11±74.21# 1.97±1.57*

表2 小鼠水迷宮實驗結(jié)果（±s）

表2 小鼠水迷宮實驗結(jié)果（±s）

與模型對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

組 別 n正常對照組 12模型對照組 12丹參紅花提取物低劑量組（10 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物中劑量組（20 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物高劑量組（40 mg/kg·d） 12潛伏期（h） 錯誤次數(shù) 24 h潛伏期 24 h錯誤次數(shù)11.52±2.58* 24.25±7.12* 8.39±2.87* 14.98±6.88*28.82±10.95 37.32±11.65 16.35±5.01 17.55±4.75 27.90±9.88 34.32±7.42 16.48±8.42 16.99±5.76 27.59±7.35 33.12±9.77 15.77±5.54 15.85±5.91 21.98±6.88* 31.99±9.87* 11.27±2.81# 14.75±7.54*

表3 小鼠血漿、肝、腦、腎、肌肉組織中MDA含量（±s，nmol/mg）

表3 小鼠血漿、肝、腦、腎、肌肉組織中MDA含量（±s，nmol/mg）

與模型對照組比較，*P<0.05

組 別 n正常對照組 12模型對照組 12丹參紅花提取物低劑量組（10 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物中劑量組（20 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物高劑量組（40 mg/kg·d） 12 MDA血漿 肝 腦 腎 肌肉5.14±1.18* 0.89±0.44* 1.60±0.32 0.87±0.17* 0.90±0.29 8.35±2.35 1.27±0.24* 1.82±0.50* 1.14±0.21* 1.21±0.21*7.02±0.61 1.08±0.17 1.68±0.31 1.03±0.23 1.22±0.31 6.98±0.48 0.99±0.18 1.59±0.24 0.99±0.20 1.01±0.15 5.69±0.58* 0.93±0.22* 1.41±0.25 0.82±0.18 0.92±0.14*

表4 小鼠血漿、肝、腦、腎、肌肉組織中SOD活性（U/mg，±s）

表4 小鼠血漿、肝、腦、腎、肌肉組織中SOD活性（U/mg，±s）

與模型對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

組別 n正常對照組 12模型對照組 12丹參紅花提取物低劑量組（10 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物中劑量組（20 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物高劑量組（40 mg/kg·d） 12 SOD血漿 肝 腦 腎 肌肉652.8±22.5* 69.2±4.8* 138.1±13.1* 47.3±3.9* 70.9±8.4 584.2±35.4 60.4±2.1 120.1±11.8 40.6±2.5 72.2±4.1 594.7±23.2 60.4±3.9 122.1±12.6 40.8±2.7 70.7±8.2 654.7±25.0 64.7±4.0 130.1±15.6 44.9±3.3 70.6±7.9 662.6±51.8# 69.8±5.8* 133.1±16.2* 45.1±2.7* 72.5±5.7

3 討 論

衰老是分子、細胞、器官乃至機體整體功能衰退綜合的復(fù)雜生理、病理變化過程。衰老的機制十分復(fù)雜，但是自由基致衰老的理論得到了學(xué)者們的認可。該理論認為，機體在細胞代謝過程中不斷產(chǎn)生的自由基，具有極強的氧化能力，會損傷蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子并引起結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致生物體整體衰老[2]。在生物體衰老過程中，神經(jīng)系統(tǒng)也逐步發(fā)生衰退，進而產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶能力下降等現(xiàn)象，這是衰老的重要特征之一。因此，尋找開發(fā)提高學(xué)習(xí)記憶能力的方法和藥物，是抗衰老藥理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)的重要內(nèi)容。

D-半乳糖致衰老小鼠由我國提出并在國際上得到認可，該模型小鼠表現(xiàn)由衰老、學(xué)習(xí)記憶功能障礙、免疫功能低下等一系列自然衰老的現(xiàn)象，是進行學(xué)習(xí)記憶功能、衰老等研究的良好模型，D-半乳糖誘發(fā)動物衰老和癡呆樣行為及病理性改變的研究頗多，其發(fā)生機制與氧化應(yīng)激損傷和自由基毒性有關(guān)。D-半乳糖作為氧化性物質(zhì)，大劑量注射后可在細胞內(nèi)被醛糖還原酶催化還原成過多的半乳糖醇，后者在細胞內(nèi)堆積而影響細胞正常滲透壓，導(dǎo)致細胞腫脹和功能障礙。同時，D-半乳糖可誘發(fā)體內(nèi)自由基蓄積，使得蛋白、脂質(zhì)及核酸過氧化，引起線粒體結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂，出現(xiàn)能量代謝障礙，導(dǎo)致細胞損傷。過多的自由基和NO也會引起腦神經(jīng)細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，而影響膜通透性及離子轉(zhuǎn)運，觸發(fā)Ca2+內(nèi)流；腦細胞內(nèi)Ca2+超載，進一步干擾線粒體氧化磷酸化過程，以至能量產(chǎn)生進一步障礙;并引起中性蛋白酶活性的病理性增加，可使細胞膜結(jié)構(gòu)分解，神經(jīng)元骨架破壞導(dǎo)致細胞死亡[3]。

丹參紅花提取物由植物丹參、紅花提取而得，其主要成分有丹參素、丹參酮、紅花甙、新紅花甙等主要成分。近年來在臨床上有了廣泛應(yīng)用，主要用于抗心絞痛和冠心病的治療。本實驗利用D-gal誘導(dǎo)小鼠衰老模型，采用Y型迷宮和跳臺檢測學(xué)習(xí)記憶功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型對照組小鼠跳臺錯誤次數(shù)和迷宮錯誤次數(shù)明顯增多，MDA含量非常顯著增高，SOD活力顯著降低。提示用D-gal誘導(dǎo)小鼠的衰老模型成功。而丹參紅花提取物能明顯降低跳臺錯誤次數(shù)和迷宮測試潛伏期，能明顯提高SOD的活力，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，這表明丹參紅花提取物具有提高學(xué)習(xí)記憶能力，延緩衰老的作用。其機理可能與其清除體內(nèi)自由基，提高機體抗氧化能力有關(guān)，此方面與報道的丹參紅花提取物保護內(nèi)皮細胞抗氧化作用機理相一致[4]。本研究為丹參紅花提取物在臨床上的進一步應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

[1]周 松，陳 騰，王青莉.丹參注射液的藥理作用及臨床應(yīng)用綜述[J].中國藥師，2008，27(8):805-808.

[2]Sohal RS.Role of oxidative stress and protein oxidation on the aging process[J].Fress Radic Biol Med，2002，33(1):37-44.

[3]Song X,Bao M,Li D,et al.Advanced glycationin D-galactose induced mouse aging model[J].Mechanism of Aging and Development，1999，108(3):239-251.

[4]滿 永，丁 莉，郭漢幫，等.丹參紅花提取物保護內(nèi)皮細胞免受氧化損傷的體外實驗[J].中國臨床康復(fù)，2006，10(39)：119.