張 濤,田黎明,王 昭,田麗華

(佳木斯大學醫(yī)學院,黑龍江佳木斯 154007)

白花敗醬草是敗醬科草本植物的根莖及帶根全草,具有清熱利濕、解毒排膿、活血化瘀、改善肝功能、抑菌和抗病毒等作用[1]。民間驗方中與其它中藥配伍,用于治療腸癌和膀胱癌[2]。有報道此藥可抑制鼠源性腹水癌[3]。但有關白花敗醬草皂苷在抗腫瘤方面的作用,國內外尚未見報道。本實驗探討白花敗醬草的抗腫瘤作用與機制,為尋找有效的抗腫瘤藥物提供部分理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及處理

昆明種雌性小鼠(6周齡20～22g),中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所繁育場提供。動物隨機分瘤源鼠組、皂苷低組(50mg/kg?d)、皂苷高組(100mg/kg? d)、CTX(環(huán)磷酰胺25mg/kg?d)組及對照組。每組10只,瘤源鼠組腹腔注射U14細胞株0.2mL/只,注射7d后在無菌條件下吸取腹腔中的腹水型瘤細胞,稀釋成 1.6×106個/mL,無菌條件下給其余5組小鼠每只左前腋下接種0.2mL瘤細胞。在接種瘤細胞24h后,給各組鼠灌服皂苷,對照組灌服同劑量的涼開水;CTX組按25mg/kg?d腹腔注射 CTX;連續(xù)14d,第15天小鼠摘眼球取血后,斷髓處死,剝離瘤體稱重。

1.2 瘤細胞株

U14鼠宮頸癌細胞株購自中國醫(yī)學科學院細胞庫。

1.3 藥物制備及主要試劑

白花敗醬草購于中國河北省秦皇島市民樂醫(yī)藥公司,由安國市昌達中藥材飲片有限公司提供,此藥通過秦皇島市藥材公司鑒定。白花敗醬草粉碎按1:10用70%食用酒精浸泡4h,加熱回流提取2次濾液,減壓回收乙醇,得白花敗醬草醇粗提物[4],此醇提物上AB8大孔吸附樹脂層析柱后用蒸餾水洗脫至洗脫液中無糖為止(M olish反應陰性)。再分別用30%、50%和70%乙醇洗脫,收集各濃度的洗脫液,至各洗脫液Liberman-Burchard反應陰性為止?；旌细飨疵撘?減壓濃縮真空干燥得白花敗醬草總皂苷粗提物。AB8大孔吸附樹脂購于天津南開大學化工廠,環(huán)磷酰胺(CTX):江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品,PCNA免疫組化試劑盒購于福建邁新生物技術有限公司。

表1 白花敗醬草皂苷對U14荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用(±s)

表1 白花敗醬草皂苷對U14荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用(±s)

與對照組比較**P＜0.01。

組 劑量(mg/kg) 動物數(shù) 體____重開始___________結束 開始 結束 腫瘤重量(g) 抑制率(%)對照組 10 9 24.33±1.92 32.67±2.14 2.82±0.92 CTX 組 25 10 10 24.10±1.62 28.27±2.46 1.59±0.45** 43.62皂苷低組 50 10 10 24.73±1.27 30.57±0.83 1.83±0.43** 35.11__皂苷高組 100__________________10_______________10_______________________________________________________________________________24.15±0.99_28.12±1.30_1.21±0.11**_57.09

1.4 實驗方法

腫瘤組織細胞PCNA蛋白的檢測:對照組、皂苷高及CTX組的瘤體切片采用免疫組織化學SP法檢測(按試劑盒說明書操作),光鏡下觀察PCNA蛋白的表達,判斷標準:褐色核表達的是陽性細胞,藍色核表達的是陰性細胞,隨機計數(shù)5個高倍鏡(40倍)視野中陽性細胞百分率。細胞周期分析和細胞凋亡檢測:對照組、皂苷高及CTX組的瘤體組織剪碎,用200目過濾制備單細胞懸液。離心洗滌3次后,調整細胞濃度為1×106個/mL,4℃70%的乙醇固定30min,用含RNA酶的碘化丙啶染色液染色30min后上流式細胞儀檢測DNA含量和分析細胞周期,并用Muhicycle軟件處理,得出細胞各周期的百分率和凋亡細胞百分率[8]。

1.5 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,應用SAS 9.13軟件進行統(tǒng)計學處理,組間差異的顯著性先進行完全隨機設計的方差分析,再采用 dunnet‵t檢驗 。

2 結果

2.1 白花敗醬草總皂苷對U14荷瘤鼠腫瘤的抑制率

對照組瘤體平均重量為(2.82±0.92)g,皂苷低、高和CTX組,瘤體重量分別為(1.83±0.43)g、(1.21±0.11)g和(1.59±0.45)g,給藥組瘤體重量明顯低于對照組(P＜0.01),腫瘤的抑制率分別是 35.11%、57.09%和43.62%(見表 1)。

圖1 白花敗醬草皂苷對腫瘤細胞PCNA表達的影響(SP×100)

2.2 白花敗醬草皂苷對U14荷瘤鼠腫瘤組織細胞PCNA蛋白表達的影響

皂苷高、CTX與對照組比較,PCNA蛋白的陽性細胞率明顯減少,分別是(21.8±3.19)%、(26.2±3.68)%和(80.6±6.02)%;可見各給藥組PCNA、蛋白的表達明顯低于對照組(P＜0.01,見表2,圖1)。

表2 皂苷對U14荷瘤鼠腫瘤組織細胞PCNA蛋白表達的影響

2.3 白花敗醬草皂苷對U14荷瘤鼠腫瘤組織細胞周期和凋亡的影響

皂苷高組和CTX組,處于G0/G1期的腫瘤細胞數(shù)由對照組的38.1%增加為68.5%和65.0%,而處于S期和G2/M期細胞的百分數(shù)減少;腫瘤細胞凋亡數(shù)由對照組的(9.42±0.16)%增至(28.92±1.24)%和(23.86±0.13)%,結果見表3,圖2。

表3 白花敗醬草皂苷對U14荷瘤鼠腫瘤組織細胞周期和凋亡的影響

圖2 白花敗醬草皂苷對U14荷瘤鼠腫瘤組織細胞周期的影響

3 討論

腫瘤發(fā)生的主要特征是細胞周期失調后導致的細胞無限制增殖,阻止癌細胞分裂即可達到抑制其惡性生長甚至將其殺滅的目的,實際上多數(shù)腫瘤化療藥物均是細胞周期的抑制劑。腫瘤細胞增殖的速度主要決定于G0/G1期的長短及參與分裂的細胞數(shù)量的多少[5]。本實驗灌服100mg/kg?d皂苷和25mg/kg?d腹腔注射CTX后,U14荷瘤鼠瘤體組織細胞處于G0/G1期的細胞數(shù)由對照組的38.1%增加為68.5%和65.0%,而處于S期和G2/M期細胞的百分數(shù)減少,可見敗醬草皂苷和環(huán)磷酰胺可使腫瘤細胞主要受阻于G0/G1期,G0/G1期阻滯使腫瘤細胞周期延長,S期細胞減少使參與分裂的細胞數(shù)減少,進而使腫瘤細胞的增殖速度降低,達到抑制其生長繁殖的作用。誘導細胞凋亡可能是不同機制的抗癌藥物發(fā)揮作用的共同途徑[6]。本研究表明,U14荷瘤鼠灌服大劑量白花敗醬草皂苷后,腫瘤組織細胞凋亡率由對照組的(9.42±0.16)%明顯上升為(28.92±1.24)%,環(huán)磷酰胺組細胞凋亡率也增致為(23.86±0.13)%,揭示敗醬草皂苷可以誘導腫瘤細胞的凋亡,使腫瘤細胞數(shù)減少。誘導腫瘤細胞凋亡是敗醬草皂苷抑制腫瘤細胞生長的又一機制。

PCNA是細胞核內DNA聚合酶δ的輔助蛋白,許多研究發(fā)現(xiàn)PCNA在G0～G1期細胞中無明顯表達,G1晚期表達增加,S期達到高峰,G2/M期明顯下降,PCNA量的變化與DNA合成一致,可作為評價細胞增殖狀態(tài)的一個指標[7]。本研究表明,對照組腫瘤組織細胞PCNA蛋白高表達,而皂苷和CTX能抑制腫瘤細胞中PCNA的表達,同時阻止腫瘤細胞于G1期,揭示腫瘤細胞PCNA表達量與其增殖分化程度相一致,提示白花敗醬草皂苷可以抑制PCNA的表達,推測可阻止腫瘤細胞DNA的合成,達到抑制腫瘤細胞增殖的目的?？傊谆〝♂u草皂苷能抑制體內U14宮頸癌細胞的生長,其抗腫瘤作用可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡,干擾腫瘤細胞周期,抑制腫瘤細胞中PCNA基因的表達而實現(xiàn)其抑制實體瘤的生長。

[1]陳炳華.白花敗醬草食療價值高[J].植物雜志,2002,6:15

[2]劉春安,彭明.抗癌中草藥大辭典[M].武漢:湖北科學出版社,1994,624

[3]Dharmananda S.1997.The treatment of gastro-intestinal cancers with Chinese medicine.http://www.itmonline.org/arts/gicancer.htm.

[4]徐潔昕,周方欽,江放明.白花敗醬總皂甙提取工藝研究[J].山東中醫(yī)藥大學學報,2005,29(3):227-229

[5]許杜娟,吳強,楊雁.黃芪總苷的抑瘤作用及其機制[J].中國藥理學通報,2003,19(7):823-826

[6]M akin G.,Dive C.Apoptosis and cancer chemotherapy[J].Trends in Cell Biology,2001,11:22-26

[7]魏永昆.增殖細胞核抗原與腫瘤研究進展[J].國外醫(yī)學腫瘤學分冊,1996,23(增刊):47-49

[8]栗坤,王淑香,趙海峰.茜草醇提物對小鼠 U14宮頸癌抑制作用的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2008,31(6):16