袁明霞，趙輝

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

革蘭氏陰性菌疫苗在生產(chǎn)過程中常出現(xiàn)因配制工藝、抗生素不當(dāng)應(yīng)用引起菌體崩解，導(dǎo)致內(nèi)毒素釋放，使注射動(dòng)物出現(xiàn)一系列臨床反應(yīng)：腫頭，腫臉，停食停水，局部炎癥，休克，死亡；生產(chǎn)性能降低；免疫功能下降，易發(fā)病，對(duì)疫苗應(yīng)答下降。有研究報(bào)道甘氨酸（Gly）能顯著拮抗內(nèi)毒素的致熱性，能在一定程度上破壞內(nèi)毒素的超微結(jié)構(gòu)，從而干擾其活性；而多粘菌素B（PMB）是有效的內(nèi)毒素拮抗劑。本試驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用甘氨酸和多粘菌素B，確定其在仔豬水腫病多價(jià)滅活疫苗中拮抗內(nèi)毒素釋放的效果，并找出二者的最佳配合比例。

一、材料與方法

表1 PMB+Gly聯(lián)合應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn)分組情況

（一）試驗(yàn)材料

1.豬大腸桿菌生產(chǎn)菌種。豬大腸桿菌C83684、C83905、C83902株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，ED0301菌株由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司分離鑒定。

2.培養(yǎng)基。營養(yǎng)瓊脂平板和營養(yǎng)肉湯按《獸藥典》附錄方法制備。

3.試驗(yàn)動(dòng)物。體重為16～18 g小鼠和14日齡健康易感仔豬，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

中心提供。

（二）試驗(yàn)方法

1.豬大腸桿菌菌液制備。將各菌株分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板復(fù)蘇培養(yǎng)，按“規(guī)程草案”方法制備生產(chǎn)用二級(jí)菌種，以5%接種于含0.5%甘油營養(yǎng)肉湯中，逐漸增大通氣量，于37℃通氣培養(yǎng)18 h，然后分別取樣，測定菌液中細(xì)菌數(shù)量。

表2 疫苗中聯(lián)合應(yīng)用PMB+Gly對(duì)小鼠的作用效果

2.菌液濃縮與滅活。取檢驗(yàn)合格的豬大腸桿菌滅活菌液經(jīng)4 000 r/min，離心30 min，棄去7/8上清液后，將菌體懸浮，按《獸藥典》附錄方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，將各菌株菌液按1:1:1:1比例混合后，按總量0.4%加入甲醛溶液，經(jīng)37℃滅活48 h，其間每間隔2～4 h攪拌1次，然后取滅活菌液接種營養(yǎng)瓊脂平板，每個(gè)樣品接種3個(gè)平板，每個(gè)平板接種0.2 ml，置37℃培養(yǎng)48 h，檢查有無細(xì)菌生長。

3.疫苗的制備。在檢驗(yàn)合格的滅活菌液中加入終濃度為的20%氫氧化鋁凝膠和0.005%的硫柳汞防腐，制備濃縮滅活疫苗含單株菌數(shù)均不低于100×108 CFU/ml（按滅活前活菌數(shù)計(jì)算）。

4.多粘菌素B與甘氨酸的配制。用滅菌生理鹽水配制儲(chǔ)存濃度為200μg/ml的多粘菌素B和200 mg/ml的甘氨酸，分別用0.22μm的濾膜過濾，置于4℃保存。

5.疫苗中PMB+Gly聯(lián)用對(duì)小鼠毒性的觀察。選取16～18 g小鼠55只，隨機(jī)分成11組，5只/組：其中組1腹部皮下接種疫苗0.1 ml/只；另9組分別按表1中比例接種疫苗+PMB+Gly，0.1 ml/只；同時(shí)設(shè)立生理鹽水對(duì)照組，0.1 ml/只。觀察7 d，記錄注苗反應(yīng)和臨床表現(xiàn)。

6.疫苗中PMB+Gly聯(lián)用對(duì)仔豬的安全性比對(duì)試驗(yàn)。選取14日齡健康仔豬15頭，隨機(jī)分成3組，5頭/組，測定每組仔豬的直腸體溫，并計(jì)算其平均值。然后分別接種疫苗4 ml、含有PMB(2μg/ml)和Gly（20 mg/ml）的疫苗4 ml、以及生理鹽水4 ml。分別于12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h測定各仔豬的直腸體溫，計(jì)算每組仔豬體溫的平均值，并觀察其臨床表現(xiàn)。

7.疫苗中PMB+Gly聯(lián)用對(duì)仔豬的免疫原性比對(duì)試驗(yàn)。選取14日齡的健康易感仔豬10頭，隨機(jī)分成2組，將5頭/組，分別頸部肌肉接種制備的兩組疫苗2 ml/只，另3頭設(shè)為對(duì)照組，接種等劑量的生理鹽水2 ml/只。至21 d各耳靜脈注射一個(gè)致死量的混合毒素，觀察10 d，記錄仔豬的發(fā)病和死亡情況。

二、結(jié)果

1.活 菌 計(jì) 數(shù)。C83684、C83905、C83902和ED0301菌株計(jì)數(shù)結(jié)果分別為128×108CFU/ml、125×108CFU/ml、159×108CFU/ ml、131×108CFU/ml。

2.疫苗中PMB+Gly聯(lián)合應(yīng)用效果的比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果。僅接種疫苗的小鼠24 h內(nèi)出現(xiàn)眼部腫脹、部分小鼠全身肌肉震顫，在48 h內(nèi)死亡3/5。

接種含有PMB+Gly的小鼠死亡率出現(xiàn)明顯下降，當(dāng)PMB和Gly的濃度分別為2μg/ml和20 mg/ml時(shí)，二者達(dá)到最佳配合比例，小鼠未見死亡，且無可見臨床反應(yīng)；當(dāng)二者濃度過高時(shí)，個(gè)別小鼠出現(xiàn)顫抖的神經(jīng)癥狀。具體結(jié)果詳見表2。

3.疫苗中PMB+Gly聯(lián)用對(duì)仔豬的安全性比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果。3組14日齡仔豬分別接種疫苗4 ml、含有PMB(2μg/ml)和Gly（20 mg/ml）的疫苗4 ml、以及生理鹽水4 ml后，連續(xù)7 d測定每組仔豬直腸體溫，并計(jì)算其平均值，如表3。

結(jié)果表明：僅接種生理鹽水的仔豬體溫不高于39.0℃；只接種疫苗組仔豬體溫逐漸升高，48 h體溫升至最高40.1℃，此后逐漸降低，至168 h（7 d）體溫仍較其它兩組高；接種疫苗+ PMB+Gly的仔豬體溫也逐漸升高，72 h體溫升至最高39.4℃，7 d后逐漸接近正常體溫，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于僅接種疫苗組，說明PMB+Gly可以協(xié)同拮抗疫苗內(nèi)毒素引起的體溫升高。

4.疫苗中PMB+Gly聯(lián)用對(duì)仔豬免疫原性的比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明接種疫苗+PMB+Gly組仔豬的攻毒保護(hù)為4/5，與僅免疫疫苗組的攻毒保護(hù)率相同，而對(duì)照組仔豬全部死亡，詳見表4。說明含有PMB+Gly不影響疫苗的免疫效力。

表3 仔豬體溫平均變化情況

表4 對(duì)仔豬的免疫原性比較

三、討論

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上一種大分子有機(jī)化合物，主要成分為脂多糖，其結(jié)構(gòu)具有高度的穩(wěn)定性，160℃需2～4 h才能滅活。在革蘭氏陰性菌疫苗的制備過程中因培養(yǎng)、離心、配制等工藝使得菌體崩解，從而引起內(nèi)毒素釋放，動(dòng)物免疫后，常出現(xiàn)腫頭，腫臉，停食停水，局部炎癥，休克，死亡；生產(chǎn)性能降低；免疫功能下降，易發(fā)病，對(duì)疫苗應(yīng)答下降等臨床反應(yīng)。

多粘菌素B（PMB）是一種環(huán)形陽離子多肽，被認(rèn)為是惟一具有抗內(nèi)毒素作用的抗生素，與LPS的活性中心Lipid A具有很高的親和力，直接與Lipid A的SO42-結(jié)合，抑制LPS的生物活性，發(fā)揮對(duì)內(nèi)毒素的中和作用。

甘氨酸（Gly）是機(jī)體固有的最簡單的氨基酸，具有兩性游離的特點(diǎn)，通過其氨基與內(nèi)毒素結(jié)合而改變了內(nèi)毒素正常結(jié)構(gòu)，也可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL-1、TNF的分泌，降低內(nèi)毒素與單核細(xì)胞的結(jié)合率，

國內(nèi)外的研究結(jié)果表明，選擇分別作用于內(nèi)毒素分子結(jié)構(gòu)中的不同部位的兩種拮抗劑同時(shí)應(yīng)用，或者利用兩種拮抗劑同時(shí)阻斷內(nèi)毒素作用的多個(gè)環(huán)節(jié)，會(huì)取得更理想的效果，并且兩種拮抗劑同時(shí)應(yīng)用，還可因減少單一拮抗劑的用量而降低藥物的毒副作用。

根據(jù)這個(gè)思路，我們選定了Gly與PMB聯(lián)合作用于仔豬水腫病多價(jià)滅活疫苗，試驗(yàn)證實(shí)二者聯(lián)用能夠較為明顯的協(xié)同拮抗疫苗中內(nèi)毒素對(duì)小鼠的致死作用和對(duì)仔豬的致熱性作用，并確定了Gly與PMB的最佳協(xié)同比例。Gly與PMB聯(lián)合應(yīng)用于仔豬水腫病多價(jià)滅活疫苗的嘗試，為其它革蘭氏陰性菌疫苗的開發(fā)開辟了一條新的研究思路。

（略）