周苗苗 吳躍明 劉紅云 趙 珂 劉建新

(浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310029)

小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2在奶牛乳腺小肽攝取中的作用研究

周苗苗 吳躍明*劉紅云 趙 珂 劉建新*

(浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310029)

本試驗(yàn)旨在研究2型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(oligopeptide transporter 2，PepT 2)在奶牛乳腺組織吸收利用小肽合成乳蛋白過(guò)程中的作用。在體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的苯丙氨酸二肽(Phe-Phe)(0和11.7μg/m L)和/或焦碳酸二乙酯(DEPC)(0、0.01、0.1、0.5和1.0 mmol/L)進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)束后收集乳腺組織和培養(yǎng)液分別用于基因表達(dá)和乳蛋白合成的檢測(cè)。結(jié)果表明，Phe-Phe促進(jìn)了PepT 2和αs1－酪蛋白基因表達(dá)及乳蛋白合成(P＜0.05);隨DEPC添加濃度的升高，αs1－酪蛋白基因表達(dá)(P＜0.01)和乳蛋白合成(P＜0.05)顯著降低;0.5 mmol/L DEPC顯著降低了Phe-Phe組αs1－酪蛋白的基因表達(dá)(P＜0.05)和乳蛋白合成(P＜0.01)以及不添加小肽組乳蛋白合成(P＜0.05)，但不影響不添加小肽組αs1－酪蛋白基因表達(dá)(P＞0.05)。結(jié)果提示，奶牛乳腺能攝取Phe-Phe用于乳蛋白的合成，PepT 2可能在乳腺小肽攝取過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

二肽;PepT 2;酪蛋白;DEPC;奶牛乳腺組織

隨著反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)和氨基酸營(yíng)養(yǎng)研究的深入，小肽在反芻動(dòng)物乳腺蛋白質(zhì)合成中的作用已引起重視。有研究表明，25%以上的乳蛋白合成原料來(lái)自于過(guò)瘤胃小肽［1］。除氨基酸之外，乳腺組織很可能直接攝取和利用血液中的小肽和多肽作為合成酪蛋白等的前體物質(zhì)。研究證實(shí)，給體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中添加適當(dāng)濃度的蛋氨酸或賴氨酸小肽能促進(jìn)酪蛋白的基因表達(dá)和乳蛋白合成［2－4］。然而，泌乳反芻動(dòng)物乳腺對(duì)小肽的攝取和利用是一個(gè)較復(fù)雜的過(guò)程，其具體機(jī)制還不清楚。乳腺上皮細(xì)胞如何攝取并利用小肽方面，目前仍沒(méi)有定論。有研究用反轉(zhuǎn)錄PCR和免疫化學(xué)的方法檢測(cè)到大鼠、人和奶牛的乳腺中均有2型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(oligopeptide transporter 2，PepT 2)表達(dá)［5－6］，這為進(jìn)一步研究乳腺對(duì)小肽的攝取機(jī)制提供了基礎(chǔ)。哺乳動(dòng)物PepT 2是一種高親和力低容量的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，它利用電子梯度逆濃度轉(zhuǎn)運(yùn)短鏈肽和肽結(jié)構(gòu)類似物到各種細(xì)胞內(nèi)，主要在腎臟上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)［7］。PepT 2蛋白由12個(gè)跨膜域組成，包含幾個(gè)保守的組氨酸(His)殘基，這些His殘基與其結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)H+/小肽相關(guān)，對(duì)維持蛋白質(zhì)正常功能必不可少［8－9］。另有研究報(bào)道，His變性劑焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)能完全阻斷大鼠腎近曲小管細(xì)胞(SKPT)對(duì)二肽的吸收［10］。因此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)研究小肽和DEPC對(duì)PepT 2基因表達(dá)以及乳蛋白合成的影響，試圖揭示PepT 2在奶牛乳腺小肽攝取過(guò)程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 奶牛乳腺組織體外培養(yǎng)

取泌乳中期的中國(guó)荷斯坦奶牛乳腺組織，清洗并剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小。將組織塊種植于6孔板上(Corning，USA)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)。待組織貼壁后每孔添加2 m L培養(yǎng)液。培養(yǎng)液成分為:基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM(dulbecco’s modified Eagle’s medium)-F12(Gibco，USA)添加1%谷氨酰胺、100 IU/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素、5μg/m L胰島素(Sigma，USA)、500 ng/m L 催乳素(Sigma，USA)、1μg/m L氫化可的松(Sigma，USA)以及10%的胎牛血清(FCS)(杭州四季青)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)處理培養(yǎng)液中去除胎牛血清、補(bǔ)充幾種必需氨基酸(表1)，并按以下試驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整相應(yīng)氨基酸和小肽的濃度。

表1 培養(yǎng)液中幾種必需氨基酸的最終濃度Table 1 Final concentrations of several essential am ino acids in medium μg/m L

1.2.1 苯丙氨酸二肽等量替代10%總游離苯丙氨酸

以培養(yǎng)液中Phe總量(117μg/m L)10%的二肽結(jié)合Phe(Phe-Phe，純度＞98%，杭州中肽)替代等量的Phe作為試驗(yàn)培養(yǎng)液孵育乳腺組織48 h。

1.2.2 不同濃度DEPC的添加

在含有10%Phe-Phe(11.7μg/m L)的培養(yǎng)液中分別添加 0、0.01、0.1、0.5 和 1.0 mmol/L 的DEPC用于奶牛乳腺組織的培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

在不含小肽和含10%Phe-Phe(11.7μg/m L)的培養(yǎng)液中分別添加0和0.5 mmol/L DEPC(由上述試驗(yàn)得出)用于奶牛乳腺組織的培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

試驗(yàn)結(jié)束后，收集乳腺組織和培養(yǎng)液分別用于總RNA的提取和總?cè)榈鞍缀康臏y(cè)定。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 RNA提取和cDNA合成

用Trizol(Invitrogen，USA)提取乳腺組織中的總RNA。RNA純度以紫外吸光法檢測(cè)(OD260nm/OD280nm＞1.80)。抽提的 RNA溶解后立即用于第1鏈cDNA的合成(PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara)。合成的cDNA貯存于－20℃冰箱中，備用。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-tim e PCR)

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)。αs1－酪蛋白、PepT 2和甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)的實(shí)時(shí)熒光定量專用引物見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，反應(yīng)體系為2μL cDNA模板加18μL PCR反應(yīng)液(SYBRPrem ix Ex TaqTMReal Time PCR試劑盒，Takara)。用三蒸水替代cDNA模版作為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件如下:95 ℃，10 s;95 ℃，5 s，40 個(gè)循環(huán);60 ℃，34 s。ABI－7500實(shí)時(shí)定量序列檢測(cè)軟件(Applied Biosystems，USA)自動(dòng)讀取 CT 值。PepT 2、αs1－ 酪蛋白和GAPDH的擴(kuò)增效率分別為101%、100%和102%。mRNA相對(duì)變化值用公式2△△Ct進(jìn)行計(jì)算。

1.5 DNA總量和培養(yǎng)液中總?cè)榈鞍缀繙y(cè)定

用Trizol提取組織中的總DNA。紫外吸光法測(cè)定DNA的純度(OD260nm/OD280nm＞1.80)和含量。DNA量的多少作為組織/細(xì)胞數(shù)量的代表用于校正培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)含量。

用冷的丙酮沉淀培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，并將蛋白質(zhì)溶于含1 mmol EDTA的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中。隨后，根據(jù) Bradford［11］的方法，用蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(博士德，武漢)檢測(cè)培養(yǎng)液中總蛋白質(zhì)含量，并以此代表培養(yǎng)液中的乳蛋白含量。

以試驗(yàn)組DNA校正乳蛋白含量［蛋白質(zhì)含量(mg)同DNA含量(μg)的比值］同對(duì)照組 DNA校正乳蛋白含量的比值作為最終結(jié)果進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理，用SAS 8.0軟件的 PROC-GLM 程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［12］，P＜0.05時(shí)差異顯著，P＜0.01時(shí)差異極顯著。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 2 Oligonucleotide primer sets for real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 Phe-Phe等量替代10%游離Phe對(duì)乳蛋白合成的影響

結(jié)果顯示，以Phe-Phe替代培養(yǎng)液中10%的游離Phe(11.7μg/m L)顯著提高了乳腺組織中PepT 2和αs1－酪蛋白的mRNA水平以及培養(yǎng)液中乳蛋白的含量(P＜0.05)(圖1)。

圖1 Phe-Phe對(duì)PepT 2和αs1－酪蛋白基因表達(dá)及乳蛋白合成的影響Fig.1 Influence of Phe dipeptide on PepT 2 and αs1-casein gene expressions and m ilk protein synthesis

2.2 PepT 2功能抑制對(duì)乳腺小肽攝取和乳蛋白合成的影響

PepT 2功能抑制劑——DEPC的添加降低了乳腺組織中αs1－酪蛋白的mRNA豐度。其中，0.5和1.0 mmol/L DEPC 添加組 αs1－ 酪蛋白的基因表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)(圖2);隨著 DEPC濃度的不斷升高，乳蛋白的合成逐漸降低。同對(duì)照組相比，0.1、0.5和1.0 mmol/L DEPC添加組培養(yǎng)液中乳蛋白的含量均顯著降低(P＜0.05)(圖3)。

圖2 DEPC濃度對(duì)αs1－酪蛋白基因表達(dá)的影響Fig.2 Influence of DEPC concentration on αs1-casein gene expression

圖3 DEPC濃度對(duì)乳蛋白合成的影響Fig.3 Influence of DEPC concentration on m ilk protein synthesis

不含小肽組添加0.5 mmol/L DEPC有降低乳腺組織中αs1－酪蛋白基因表達(dá)的趨勢(shì)(mRNA豐度降低23%)，但差異不顯著(P＞0.05);而10%Phe-Phe組添加0.5 mmol/L DEPC則顯著降低了乳腺組織中αs1－酪蛋白的基因表達(dá)，其降低幅度為29%(P＜0.05)(圖4)。

圖4 PepT 2功能抑制對(duì)αs1－酪蛋白基因的影響Fig.4 Influence of inhibition of PepT 2 function on αs1-casein gene expression

DEPC對(duì)乳蛋白合成的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。添加0.5 mmol/L DEPC顯著降低了不含小肽組培養(yǎng)液中乳蛋白的含量(P＜0.05)，極顯著降低了10%Phe-Phe組培養(yǎng)液中乳蛋白的含量(P＜0.01)。其中，不含小肽組乳蛋白含量降低59%，而添加Phe-Phe組乳蛋白含量降低74%。

3 討論

研究證實(shí)泌乳小鼠乳腺外植體可以攝取完整形式的蛋氨酸(Met)二肽用于乳蛋白的合成［13］。眾多研究也表明奶牛乳腺可以攝取血液中存在的肽結(jié)合必需氨基酸作為乳蛋白合成的前體物［14－15］。Pan 等［16］比較了不同 Met二肽對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)中乳蛋白合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Met-Met、Met-Val和 Leu-Met的乳蛋白合成效率高于游離的 Met。W u等［4］研究結(jié)果也表明，同游離Met和Lys相比，添加Met和 Lys二肽能促進(jìn)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中αs1－酪蛋白的基因表達(dá)。本試驗(yàn)以Phe-Phe等量替代培養(yǎng)液中10%的游離Phe顯著促進(jìn)了體外培養(yǎng)的乳腺組織中αs1－酪蛋白基因表達(dá)和乳蛋白合成，表明乳腺組織可以利用Phe-Phe合成乳蛋白，且利用效率高于等量的游離Phe。該結(jié)果同上述用其他小肽所得結(jié)論一致。同時(shí)，Phe-Phe的添加也提高了PepT 2的mRNA表達(dá)水平，提示該小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體在乳腺小肽攝取方面可能發(fā)揮作用。

圖5 PepT 2功能抑制對(duì)乳蛋白合成的影響Fig.5 Influence of inhibition of PepT 2 function on m ilk protein synthesis

Brandsch等［10］利用大鼠SKPT表達(dá)高親和力載體PepT 2，研究了組氨酸抑制劑DEPC對(duì)PepT 2動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax、Km的影響。結(jié)果表明，在pH 7.5的環(huán)境下用DEPC處理后，SKPT細(xì)胞膜上的PepT 2失去結(jié)合 H+的能力，進(jìn)而顯著抑制了SKPT對(duì)甘氨酸 －肌氨酸(glycylsarcosine，Gly-Sar)的吸收，但并不影響PepT 2和底物結(jié)合的Km值。本試驗(yàn)為研究PepT 2在乳腺小肽攝取過(guò)程中的可能作用，以DEPC抑制PepT 2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能來(lái)檢測(cè)其對(duì)αs1－酪蛋白基因表達(dá)和乳蛋白合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5和1.0 mmol/L DEPC的添加顯著降低了αs1－酪蛋白基因表達(dá)和乳蛋白的合成。其機(jī)制可能是:小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合了DEPC使其蛋白質(zhì)變性，從而破壞了載體蛋白的的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，最終阻斷了乳腺通過(guò)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)小肽的攝取，抑制了小肽對(duì)乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的促進(jìn)作用。另外，DEPC還可以抑制植物細(xì)胞上的非選擇性陽(yáng)離子通道(nonselective cation channel，NSCC)，是常用的NSCC抑制劑。為避免PepT 2功能抑制劑(DEPC)通過(guò)影響乳腺組織中其他離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)載體來(lái)抑制乳蛋白合成，本試驗(yàn)比較了不添加和添加 Phe-Phe的情況下，以0.5 mmol/L DEPC抑制PepT 2功能對(duì)乳腺組織中乳蛋白合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制PepT 2功能顯著降低了添加Phe-Phe組的αs1－酪蛋白基因表達(dá)，但不影響無(wú)小肽組的αs1－酪蛋白基因表達(dá)。就乳蛋白合成而言，抑制PepT 2功能顯著降低了2組的合成量。然而，添加Phe-Phe組乳蛋白合成量降低了74%，同不添加小肽組(乳蛋白降低59%)相比，添加二肽組乳蛋白合成受PepT 2功能抑制的影響更大。由此可見(jiàn)，無(wú)論乳腺組織中其他離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)載體是否受 DEPC的影響，DEPC都通過(guò)破壞PepT 2蛋白功能抑制了乳腺中二肽的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而降低了αs1－酪蛋白基因的表達(dá)和乳蛋白的合成。因此，乳腺對(duì)小肽的攝取是通過(guò)或者至少部分通過(guò)PepT 2來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論

①奶牛乳腺組織能夠利用Phe-Phe合成乳蛋白，且Phe-Phe用于乳蛋白合成的效率高于等量游離Phe。

②2型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PepT 2)在乳腺組織小肽攝取過(guò)程中發(fā)揮積極作用。

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*Corresponding author，WU Yuem ing，professor，E-mail:ymwu@zju.edu.cn;LIU Jianxin，professor，E-mail:liujx@zju.edu.cn

(編輯 趙天章)

Role of O ligopeptide Transporter 2 in Bovine Mammary G land Phenylalanine Dipeptide Uptake

ZHOU Miaom iao WU Yuem ing*LIU Hongyun ZHAO Ke LIU Jianxin*
(Institute of Dairy Science，Ministry of Education Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition，Zhejiang University，Hangzhou310029，China)

This experimentwas conducted to study the role of oligopeptide transporter 2 in small peptides uptake and m ilk protein synthesis in bovine mammary gland.Different doses of Phe dipeptide(0 and 11.7 μg/m L)and DEPC(0，0.01，0.1，0.5 and 1 mmol/L)were added to the culture medium of bovine mammary gland tissues.After incubated in the experimentalmedium，mammary tissues and medium were collected and used for gene expression and m ilk protein determ ination，respectively.The results showed that 1)Phe dipeptide increased oligopeptide transporter 2 andαs1-casein gene expression and m ilk protein quantity in themedium(P＜0.05);2)with increasing of DEPC dose，αs1-casein gene mRNA level(P＜ 0.01)and synthesis ofmilk protein(P＜0.05)were decreased;3)treatmentwith 0.5 mmol/L DEPC significantly decreased αs1-casein gene expression(P＜0.05)and synthesis of m ilk protein(P＜0.01)in Phe dipeptide group，and synthesis ofm ilk protein(P＜0.05)in free Phe group，but had no effect on αs1-casein genemRNA level(P＞0.05)in free Phe group.These results indicate that Phe dipeptide can be used for synthesis of m ilk protein by bovinemammary gland while PepT2 may play an important role in small peptides uptake by bovinemammary gland.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(8):1303-1308］

dipeptides;PepT 2;casein;DEPC;bovinemammary gland tissues

S823

A

1006-267X(2011)08-1303-06

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.08.008

2011－02－25

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2011CB100801);浙江省自然科學(xué)基金(Z305036)

周苗苗(1984—)，女，山東聊城人，博士研究生，從事奶牛乳腺氨基酸和小肽營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail:zhoumm0329@163.com

*通訊作者:吳躍明，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:ymwu@zju.edu.cn;劉建新，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:liujx@zju.edu.cn