程 鵬, 張愛兵

首都師范大學生命科學學院，北京 100048

生命條形碼新秀:DNA微型條形碼技術

程 鵬, 張愛兵

首都師范大學生命科學學院，北京 100048

近些年來，DNA條形碼技術為便捷的物種鑒定提供了很大的幫助，但隨著該技術的發(fā)展，也出現(xiàn)了一系列的問題。微型條形碼技術是作為DNA條形碼技術的補充而出現(xiàn)的一項新興技術，具體是指通過通用引物擴增出比細胞色素c氧化酶I號基因全序列更短的一段序列，并通過該序列進行物種鑒定、分類等研究工作。作為一項新興技術，其優(yōu)點包括，適用于部分降解的DNA樣品的目的基因擴增，能夠很好地解決環(huán)境混合樣品多樣性的調查等。但是，該技術所選DNA片段非常短，因此標記序列包含的遺傳信息有限，在鑒定的精確度方面和COI全條形碼存在一定的差距。本文在總結前人研究的基礎上，簡要概述了微型條形碼技術的優(yōu)缺點，并對其未來在害蟲分子識別方面的應用做了初步探討。

微型條形碼； 物種鑒定； DNA降解； 環(huán)境混合樣品

由于資金的限制及年輕分類學家的匱乏，分類學的發(fā)展在過去幾十年里受到了嚴峻的考驗，曾一度有沉寂的趨勢(Mallet amp; Willmott，2003)，但近年來又呈現(xiàn)出勃勃生機。其中主要是因分子生物學技術和因特網的介入而提出的DNA分類學和DNA條形碼(Hebertetal.,2002)。DNA條形碼是指一段特殊的DNA序列，既可以用于辨別物種，還可以用于研究近緣種之間的進化關系(Hebertetal.,2003)。

在Hebert等人研究的基礎上，許多科學家接受了將細胞色素c氧化酶I號(COI)基因序列作為動物DNA條碼的設想(Tautzetal.，2003)，這個序列也逐步成為了物種鑒定最常用的分子標記之一。從此，生命條形碼工程便成為科學家們的一個宏偉計劃，即試圖建立一個基于標準的分子序列的物種鑒定系統(tǒng)(Frezal amp; Leblois，2008)。但是，隨著DNA條形碼技術研究的深入與推廣，人們發(fā)現(xiàn)其在實際工作中常常受到限制。如對待檢標本要求高、在館藏標本中的應用難度大等。DNA微型條形碼的出現(xiàn)，在很大程度上彌補了以上傳統(tǒng)條形碼的缺點與不足，其在物種鑒定上的使用也越來越廣泛，并取得了一系列的成果(Milleretal.,2005;歐陽小艷等，2007;Wardetal.,2009)。本文就該技術的研究成果及優(yōu)缺點做簡要概述，并對其將來可能應用的方向做初步的探討，以期為微型條形碼技術的完善及其對外來入侵害蟲的防治方面提供參考。

1 DNA條形碼的定義及微型條形碼的研究成果

1.1 DNA條形碼的定義及其序列特征

DNA條形碼是指線粒體氧化酶C從5′端開始的一段長度約650 bp的DNA序列(Hebertetal.,2002)。能夠用于條形碼的基因必須具備2個看似矛盾的特征：(1)相對的保守性，便于用通用引物擴增出來；(2)足夠的變異性,以便將物種區(qū)別開來。綜合基因序列的長度和進化速率2個條件，最終選定COI序列,即一段約650個堿基長度的片段作為條形編碼基因。這是因為：(1)動物生命中絕大部分階段都有COI基因序列；(2)大多數(shù)細胞中都有上百個線粒體，但只有一組染色體，因此等量的樣品中，線粒體的DNA更容易被放大和使用；(3)與細胞核的DNA相比，線粒體DNA的突變速度是核DNA的10倍，意味著核DNA能夠保留原來的變異而線粒體原來的變異會很快地丟失，使物種分離更準確；(4)線粒體的遺傳方式屬于母性遺傳，COI基因位于細胞線粒體中，因此只能從母體中遺傳，這樣基因重組的發(fā)生率低；(5)它還擁有蛋白編碼基因所共有的特征，即密碼子第三位堿基不受自然選擇壓力的影響,可以自由變異；(6)COI基因在能夠保證足夠變異的同時又很容易被通用引物擴增，其DNA序列本身很少存在插入和缺失(即使有少數(shù)也主要分布于該基因的3′端，對結果的分析不會造成很大的影響)。COI基因序列現(xiàn)已成為鑒定動物的DNA條形碼。

1.2 DNA微型條形碼的研究成果

DNA微型條形碼開始是針對博物館標本提出的(Hajibabaeietal.,2006)，近年來，中外學者對此做了一系列的嘗試并取得了一定的成果。Hajibabaeietal.(2006)證明了可以從已經發(fā)生DNA降解的館藏標本中擴增出134 bp的目的基因；同時通過對來自哥斯達黎加地區(qū)的寄生蜂進行試驗，驗證了135 bp的COI序列可以很好地應用于物種鑒定。盡管COI序列的內部切割思想在當時非常新穎并且對條形碼技術的發(fā)展起到了很大作用，但其工作是基于計算機模擬，并未考慮擴增微型條形碼的引物設計問題，缺乏實際證明。在此基礎上，Meusnieretal.(2008)通過對現(xiàn)有DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中的已測序列進行計算得到，隨著被擴增序列長度的縮短，其引物的通用性增強，但縮短的序列鑒定物種的能力會有一定的減弱。當COI序列長度大于100 bp時即可鑒定90%以上的物種；擴增130 bp的部分COI序列比擴增650 bp的COI序列容易；同時，他們將這段130 bp的條形碼應用于鱗翅目蛾類館藏標本的鑒定研究，結果證明了該條形碼在館藏標本鑒定中的正確性。從此，DNA微型條形碼技術逐漸走向成熟。Dubeyetal.(2009)將復合引物PCR技術與微型條形碼技術結合起來，直接將PCR的產物電泳條帶(380、265、130 bp)用于印度瀕危蛇類的鑒定。這在一定程度上利于新物種的發(fā)現(xiàn)，并且節(jié)約了大量成本。但是，PCR條帶始終無法直接反映DNA序列的內部信息，因此還需要提升測序技術。范京安等(2009)也將微型條形碼技術用于海關檢驗中果實蠅的物種鑒定。其以一種生物信息學模擬與試驗相結合的方法，進一步證明了微型條形碼可以用于物種鑒定，并且運用統(tǒng)計學的方法從基因位點的統(tǒng)計數(shù)據(jù)上對微型條形碼的應用提供了進一步的理論支持。

1.3 DNA微型條形碼的基本操作過程

DNA微型條形碼的基本操作過程主要包括：(1)樣品的采集與處理；(2)基因組DNA的提取及電泳確認；(3)利用COI全條形碼的傳統(tǒng)引物擴增COI基因片段及電泳檢驗；(4)當步驟(3)確認無法擴增出完整的COI時，利用微型條形碼的通用新型引物擴增部分COI基因片段及電泳確認；(5)PCR產物的純化與克隆；(6)測序和序列分析；(7)微型條形碼數(shù)據(jù)庫的構建以及在相關領域中的具體應用。

2 傳統(tǒng)分類方法、DNA條形碼技術與微型條形碼技術的比較

2.1 傳統(tǒng)分類方法的貢獻與不足

盡管傳統(tǒng)的形態(tài)分類為分類學奠定了基礎、提供了框架和依據(jù)，但其鑒定手段復雜且效率不高，對工作人員的經驗和專業(yè)有相當高的要求。常規(guī)形態(tài)學鑒定方法有4個方面的缺陷：(1)由于物種表型的可塑性和遺傳的可變性，容易導致不正確的鑒定；(2)無法鑒定許多群體中普遍存在的隱存分類單元；(3)受生物性別和發(fā)育階段的限制，很多生物無法被鑒定；(4)雖然現(xiàn)代交互式鑒定系統(tǒng)是一個很大的進步，但它要求很高的專業(yè)技術，一旦操作不正確則很容易導致錯誤的鑒定結果?！靶螒B(tài)學鑒定的局限性和不斷縮減的分類學家隊伍，使分類學的發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)，亟需一種快捷方便的物種鑒定方法產生”(Hebertetal.,2003)。

2.2 DNA條形碼技術的優(yōu)點與不足

首先，DNA條形碼技術的運用改善了分類學多年不夠活躍給生物科學帶來的負面影響。如資源投入不足、合格的分類工作者較少等(Gotelli,2004)。DNA條形碼技術既準確、快捷，又降低了對工作者經驗的要求，使得一些難度較大或工作量較大的物種鑒定工作變得相對容易。其次，DNA條形碼對保護生物學、生物進化歷史研究的發(fā)展起著至關重要的作用。它將完成一些傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定手段無法完成的工作，如鑒定生物的卵和幼體、動物或植物的寄生物，以及解決形態(tài)學手段難以攻克的隱存種問題，或者根據(jù)對動物腸道包含物或排泄物的分析來解決食物鏈問題。這個計劃本身的發(fā)展，要求一系列更快、更好、更廉價技術的支持，這勢必會推動相關分子生物學技術的進步，從而讓其他相關的生物科學受益。此外，DNA條形碼技術也可以為入侵生物的預防和控制研究提供幫助(Armstrong amp; Ball,2005)。

同時，DNA條形碼技術也存在一些問題。如DNA的易降解性大大制約了條形碼技術的適用范圍，而且該技術在館藏標本以及福爾馬林浸泡的標本上應用也達不到預期的效果。對于線粒體變異速率的要求，即適度的變異速率也是對DNA條形碼的制約因素之一，如植物的線粒體具有極端的進化保守性，即其DNA異質化程度相當?shù)?，所以，COI序列不能作為鑒定植物的條形碼序列。此外，由于不同的引物對片段的擴增有偏向性(Bellemainetal.,2010)，DNA條形碼技術在新物種的確定以及環(huán)境混合樣品的分析中也存在一些問題。如DNA條形碼技術一般要求完整的COI序列長度為650 bp，這使得引物的通用性無法滿足不同物種的要求(Meusnieretal.,2008)。因此，在建立國際DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的進程中，必須去攻克這些隨之而來的問題，否則，DNA條形碼生命數(shù)據(jù)系統(tǒng)(BOLD)永遠不可能成為一個普適性的系統(tǒng)(Frezal amp; Leblois,2008)。

2.3 微型條形碼技術的優(yōu)勢與缺陷

隨著生命條形碼工程的不斷發(fā)展，一系列的問題需要新的技術來完善和補充，從而使DNA條形碼能發(fā)展得更好。正如條形碼的倡導者Hebert所言“微型條形碼系統(tǒng)顯著地擴大了DNA條形碼技術的應用范圍，我們已經驗證了可以從已經降解的館藏標本中擴增出微型條形碼；另外，配合高通量測序技術，微型條形碼引物的通用性使得研究環(huán)境混合樣品成為了可能，一種廉價而全面的研究生物多樣性的方法成為了現(xiàn)實”(Meusnieretal., 2008)。因此，微型條形碼憑借其引物的通用性強、擴增能力高，且較強的物種分類能力，得到越來越廣泛的應用。如Dubeyetal.(2010)通過蛇殘片微型條碼的檢測，來防止一些非法商人對珍稀蛇類的捕殺。

由于DNA微型條形碼技術現(xiàn)階段主要還是基于COI序列中的一段，許多COI全條形碼技術中的缺陷同樣存在于微型條形碼分類技術中。第一，采樣不足在很多時候會造成條形碼庫出現(xiàn)鑒定盲區(qū)(Meyer amp; Paulay,2005),因此，在采樣過程中，應盡可能采到絕大部分已經確認存在的種并保證其足夠的個體數(shù)量。這一點在實際工作中往往會成為建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的一個制約。第二，由于線粒體DNA的遺傳主要由母系決定，線粒體的母系遺傳成為分析COI序列過程中需要考慮的因素。已有研究證明，僅僅使用COI序列在一些時候不能正確地鑒定物種的種類(Burnsetal.，2007)。因此，在微型條形碼技術的使用中，同樣要考慮這一點。第三,對于10倍閾值法則的爭議。在2007年Hebertetal.對北美地區(qū)260種鳥的COI基因進行了研究(Kerretal.，2007)。結果發(fā)現(xiàn)，其近源種間COI序列差異(7.0%～8.0%)約比種內(0.3%～0.4%)大20倍。因此認為，大多數(shù)北美地區(qū)的鳥類物種均可用該序列進行區(qū)分，并將10倍的種內變異(約3.0%)作為標記物種遺傳分化的“標準序列閾值”，低于此數(shù)值的物種之間即使存在生物學差異也被認為是同種。許多科學家認為，這個法則存在著很大的主觀性，并且許多情況與實際不一致(Meieretal.,2008)。第四，假基因在COI基因PCR過程中的出現(xiàn)也是一個值得考慮的問題(Songetal.,2008)。由于微型條形碼引物的通用性高，在實際工作中應尤為重視。第五，許多學者對單序列條形碼的信度問題始終存在著爭議，因此，許多研究選擇采用多位點基因序列分析并結合其形態(tài)信息，記錄更多的生態(tài)信息，綜合這些信息和序列比對的結果來進行物種鑒定。此外，微型條形碼較短，包含的序列信息明顯低于全條形碼，因此，在實際運用過程中，雖然鑒定物種的正確率符合預期要求，但與全條形鑒定物種的正確率相比，還有微小的差距(Meusnieretal.,2008)。

3 展望

微型條形碼技術雖然在發(fā)展中遇到一系列的問題，但隨著研究的深入，該技術將得到不斷完善。國際生物條形編碼計劃倡導全球統(tǒng)一行動，現(xiàn)在一個分子生物學實驗室平均每年可得到1000個以上物種的目的片斷序列；并且隨著DNA測序技術的革新，配合微型條形碼技術，不僅使DNA鑒定的成本大大降低，而且在一定程度上解決了DNA降解問題，條形碼數(shù)據(jù)為館藏標本的使用提供了空間，提高了生命條形碼工程的可行性以及完成速度。生命條形碼工程作為最直接的信息資源，將成為全球生物鑒定系統(tǒng)(global bioidentification system, GBS)的基礎。若該數(shù)據(jù)庫被全球生物多樣性信息機構(Global Biodiversity Information Facility)或生物物種基金(All Species Foundation)利用，網絡信息資源長期缺乏的問題將得到解決。Hebertetal.(2003)預計整個計劃的實施將花費10億美元，遠遠低于人類基因組計劃和國際空間站的成本。在保護生物學方面，DNA微型條形碼技術將對生物多樣性研究的發(fā)展起到至關重要的作用，主要體現(xiàn)在可以快速有效地完成環(huán)境混合樣品多樣性調研。在外來物種入侵防治方面，DNA微型條形碼技術為新種和隱存種的發(fā)現(xiàn)提供了必不可少的佐證(Hajibabaeietal.,2006)，因此，運用該技術監(jiān)控一個區(qū)域是否發(fā)生外來物種入侵將成為可能。

總之，DNA微型條形碼技術作為一種與傳統(tǒng)DNA條形碼技術結合的新興技術，必將推動分類學乃至整個生命科學的發(fā)展。

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Notivebarcodeoflife：DNAmini-barcodetechnology

Peng CHENG, Ai-bing ZHANG

CollegeofLifeSciences,CapitalNormalUniversity,Beijing100048,China

In recent years, DNA barcode technology make great help in identification of species, but there are some problems with the development of the technology. Mini-barcode technology as a supplement to DNA barcoding has been proposed recently. This method amplifies a sequence which is much shorter than the cytochrome c oxidase subunit I sequence by universal primers to identify and classify species. As a new technology, its advantages include, such as amplifying the target gene for partly degenerated DNA samples, as well as a good solution to the diversity of environmental investigation in mixed samples and so on. However, the target gene of the new technology is a very short DNA fragment. Therefore, the genetic marker sequence contains limited information. So, there is a certain gap between the full barcode in the accuracy of identification. Here, based on previous studies, we make a brief summary of advantages and disadvantages of DNA mini-barcode and its potential applications, especially to identification of the invasive species.

mini-barcode; species identification; DNA degradation; environmental sample

2010-12-24接受日期2011-02-01

北京市自然基金重點項目(KZ201010028028)；國家自然基金面上項目(31071963)；北京市人才強教“創(chuàng)新團隊”項目資助(PHR201107120)

張愛兵，E-mail: zhangab2008@mail.cnu.edu.cn