崔 蕾， 王振營， 何康來， 白樹雄

中國農業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193

轉Bt-cry1Ah基因玉米花粉對龜紋瓢蟲解毒酶和中腸蛋白酶活性的影響

崔 蕾， 王振營， 何康來， 白樹雄

中國農業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193

研究了取食轉Bt-cry1Ah基因玉米花粉對龜紋瓢蟲Propylaeajaponica(Thunberg)體內解毒酶和中腸蛋白酶活性的影響。利用飼喂結合比色方法，比較龜紋瓢蟲取食轉Bt-cry1Ah基因玉米花粉和非轉基因玉米花粉后體內α-乙酸萘酯酶、乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、中腸總蛋白酶、類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶的酶活性。結果發(fā)現(xiàn)：在解毒酶方面，取食Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲4齡幼蟲和蛹的α-乙酸萘酯酶活性顯著低于取食非Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲(對照組)，取食Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲的乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉移酶活性在各個發(fā)育時期與對照相比均無顯著差異。在中腸蛋白酶方面，與對照組相比，取食Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲的總蛋白酶和強堿性類胰蛋白酶活性在各個發(fā)育時期均無顯著差異；但取食Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲的弱堿性類胰凝蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶活性在蛹期顯著低于取食非Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲。由此可見，龜紋瓢蟲取食含有Cry1Ah殺蟲蛋白的玉米花粉后,體內代謝解毒酶和中腸蛋白酶與Cry1Ah殺蟲蛋白相互作用，可能會引起某些酶活性的變化。因此，轉cry1Ah基因玉米花粉對龜紋瓢蟲的潛在影響還需要進一步的研究。

轉Bt-cry1Ah基因玉米； 花粉； 龜紋瓢蟲； 解毒酶； 中腸蛋白酶； 酶活性

隨著轉基因技術的飛速發(fā)展以及轉基因玉米的大面積推廣，轉基因玉米在帶來巨大的社會、經濟和生態(tài)效益的同時，其安全性問題也引起了世界范圍內的廣泛關注(Berglsonetal.,1998; Crawleyetal.,2001; Conneretal.,2003; Hancock,2003)。自Loseyetal.(1999)報道了轉基因玉米花粉對非靶標昆蟲帝王斑蝶Danausplexippus生長發(fā)育有不利影響之后，轉基因植物對非靶標昆蟲潛在的影響倍受重視。非靶標害蟲玉米跳蟲Chaetocnemapulicar、日本麗金龜Popilliajaponica和十一星根螢葉甲Diabroticaundecimpunctata取食表達Cry1Ab殺蟲蛋白的Bt玉米后，體內都含有相當數(shù)量的Cry1Ab殺蟲蛋白(Harwoodetal.,2005)。綠草蛉Chrysoperlacarnea取食添加雪花蓮凝集素(Galanthusnivalisagglutinin,GNA)的人工飼料后，成蟲的壽命未受到影響，但GNA的聚集會對其產卵前期、日產卵量和總產卵量產生負面的影響；用添加了GNA的人工飼料飼喂的草蛉幼蟲羽化后成蟲的體重、產卵前期、日產卵量和總產卵量沒有區(qū)別，但卵的孵化率則顯著減少，所以濃度較高的GNA會對草蛉造成一些不利的影響(Li amp; Romeis,2009)。將轉cry1Ab基因玉米花粉、純化的Cry1Ab蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)分別拌入糖漿飼喂蜜蜂成蟲，結果表明,取食花粉、Cry1Ab蛋白的蜜蜂存活率和下咽腺的生長發(fā)育均無明顯差異，而取食SBTI的蜜蜂下咽腺管的平均重量、平均直徑顯著降低(Babendreieretal.,2005)。

Bt-cry1Ah基因是從我國蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)分離株BT8中克隆鑒定的新型殺蟲蛋白基因，其編碼的蛋白對亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera和水稻二化螟Chilosupperssalis等有很強的殺蟲活性(Xueetal.,2008)。我國已經將優(yōu)化的Bt-cry1Ah基因活性片段轉入玉米，獲得了遺傳穩(wěn)定的轉Bt-cry1Ah基因抗蟲玉米，并證明表達該基因的玉米對玉米螟有顯著抗性(Wangetal.,2008;岳同卿等,2010)。瓢蟲有取食花粉的習性(Woldetal., 2001)，由于玉米散粉期有大量的花粉沉積在植株葉腋處，而瓢蟲等捕食性天敵常在葉腋處活動，這增加了瓢蟲接觸到殺蟲蛋白的風險(邢珍娟等，2008)。研究表明，轉cry1Ab基因玉米花粉對斑鞘飾瓢蟲Coleomegillamaculata和異色瓢蟲Harmoniaaxyridis的生長發(fā)育和產卵情況等沒有不利的影響(Lundgren amp; Wiedenmann,2002;張永軍等,2005)，但是否對龜紋瓢蟲Propylaeajaponica的生理代謝有影響，尚未見報道。本試驗研究轉Bt-cry1Ah基因玉米花粉對龜紋瓢蟲體內解毒酶和中腸蛋白酶活性的影響，以期為轉基因抗蟲玉米的環(huán)境安全性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試玉米花粉

轉Bt-cry1Ah基因玉米(以下簡稱Bt玉米)及其親本X090(以下簡稱非Bt玉米)由中國農業(yè)科學院生物技術研究所提供。玉米種植于中國農業(yè)科學院廊坊試驗基地農業(yè)部轉基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心(北京)試驗地。散粉前在玉米雄穗上套上授粉袋，分別收集Bt玉米和非Bt玉米花粉，迅速帶回實驗室，將花粉轉移到密封塑料袋中，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 供試昆蟲及飼養(yǎng)方法

龜紋瓢蟲由北京市農林科學院植物保護環(huán)境保護研究所提供，麥長管蚜Sitobionavenae由中國農業(yè)科學院植物保護研究所小麥害蟲組提供。瓢蟲飼養(yǎng)在塑料養(yǎng)蟲籠(30 cm×25 cm×30 cm)中，置于光照培養(yǎng)箱(溫度25 ℃，RH60%～70%，L∶D=16∶8)待產卵。麥長管蚜飼養(yǎng)在小麥苗上，并置于光照培養(yǎng)箱(溫度23 ℃，RH60%～70%，L∶D=16∶8)中。待瓢蟲卵孵化后，將初孵的龜紋瓢蟲幼蟲單頭飼養(yǎng)在塑料培養(yǎng)皿(6 cm×6 cm)內，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)皿中放清潔保濕棉球，每天更換1次。瓢蟲幼蟲和成蟲每天飼喂足量的蚜蟲1次。

1.3 瓢蟲體內代謝解毒酶活性測定

1.3.1 酶提取液的制備 每24頭初孵瓢蟲幼蟲為1組，共10組。其中，5組用Bt玉米花粉與蚜蟲按2∶1(重量比)混合喂養(yǎng)，作為處理組；5組用非Bt玉米花粉與蚜蟲按2∶1混合喂養(yǎng)，作為對照組。分別取瓢蟲2、3、4齡幼蟲，蛹和羽化后第10 d的成蟲蟲體各8頭，放入玻璃勻漿器中，加入500 μL pH 8.0的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(含0.1% TritonX-100)，冰浴勻漿，勻漿液在4 ℃、12000×g離心機上離心30 min，取上清液作為酶提取液。每個處理重復3次。

1.3.2 α-乙酸萘酯酶活性測定 測定方法參照van Asperen (1962)并加以改進。反應混合液中含有10 μL酶液、90 μL 0.04 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.0)、50 μL 0.0004 mol·L-1α-乙酸萘酯液。在37 ℃水浴中保溫30 min,加入50 μL顯色劑(1%固牢藍B鹽與SDS溶液按2∶5混合)，室溫下放置10 min, 置于酶標儀(Bio-Rad公司，Microplate Reader550)中，在600 nm處比色，測其D值。設定每15 s記錄1次D值，共記錄30次。

1.3.3 乙酰膽堿酯酶活性測定 測定方法參照Ellman (1961)并加以改進。取10 μL酶液、90 μL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 8.0)、20 μL 0.075 mol·L-1碘化乙酰膽堿、30 μL 0.01 mol·L-1DTNB液，在25 ℃水浴中保溫15 min，加入50 μL 0.01 mol·L-1毒扁豆堿，置于酶標儀中，在410 nm處比色，測其D值。記錄方式同1.3.2。

1.3.4 谷胱甘肽-S-轉移酶活性測定 測定方法參照Booth (1961)并加以改進。反應混合液中含有10 μL酶液、90 μL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 8.0)、50 μL 0.03 mol·L-1谷胱甘肽液、50 μL 0.1 mol·L-1CDNB液。在25 ℃水浴中反應30 min，加熱使其失活，置于酶標儀中，在340 nm處比色，測其D值。記錄方式同1.3.2。

1.4 主要中腸蛋白酶活性測定

測定方法參照王琛柱和欽俊德(1996)并加以改進。

1.4.1 中腸酶液的制備 每24頭初孵瓢蟲幼蟲為1組，共10組，試蟲同1.3.1。分別取瓢蟲2、3、4齡幼蟲，蛹和羽化后第10 d的成蟲蟲體各8頭，放入玻璃勻漿器中，加入預冷的0.15 mol·L-1氯化鈉后，冰浴勻漿，然后將勻漿液轉入離心管離心15 min (4 ℃，12000×g)，取上清液作為酶液，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 中腸總蛋白酶活性測定 將20 mg·mL-1偶氮酪蛋白溶于0.15 mol·L-1氯化鈉中，取40 μL該液加入5 μL酶液及20 μL 0.2 mol·L-1甘氨酸—氫氧化鈉(pH 10.0),整個反應體系于30 ℃育溫2 h,然后加入預冷的10%(V/V)三氯乙酸65 μL終止反應。最后于12000×g離心15 min，取上清液60 μL及40 μL 1 mol·L-1氫氧化鈉置于酶標儀中，于405 nm處測定D值。記錄方式同1.3.2。

1.4.3 類胰蛋白酶活性測定 (1)強堿性類胰蛋白酶。以BAPNA作為底物，將20 mg·mL-1BAPNA溶于二甲基亞砜，取45 μL該液加入90 μL 0.1 mol·L-1甘氨酸—氫氧化鈉(pH 10.0)和5 μL酶液后立即置于酶標儀中，于405 nm處測其D值。(2)弱堿性類胰蛋白酶。以TAME作為底物，將2 mmol·L-1TAME溶于0.15 mol·L-1氯化鈉中，取45 μL該液加入90 μL Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)和5 μL酶液后立即置于酶標儀中，于248 nm處測定D值。記錄方式同1.3.2。

1.4.4 類胰凝乳蛋白酶活性測定 以BTEE作為底物，將1 mmol·L-1BTEE溶于含10%(V/V)甲醇的0.15 mol·L-1氯化鈉溶液中，取50 μL該液加入45 μL 0.2 mol·L-1Tris-HCl溶液(pH8.5)和5 μL酶液后置于酶標儀中，在256 nm處測D值。記錄方式同1.3.2。

1.5 酶活性的計算

酶活性的計算參照印芳等(2008)。

酶活性=(△D×VT)/(W×VS×0.01×t)

其中,△D為1.3和1.4中不同波長下，反應時間內D的變化；VT為酶液總體積/mL；W為試驗材料鮮重/g；VS為測定時所取的酶液體積/mL；t為反應時間/min。酶活性單位為U· g-1· min-1。

1.6 數(shù)據處理

采用SPSS11.5軟件對試驗數(shù)據進行方差分析，差異顯著性(Plt;0.05)比較采用獨立樣本t測驗。

2 結果與分析

2.1瓢蟲取食Bt玉米花粉時體內主要代謝解毒酶活性的變化

從表1可以看出，取食Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲的α-乙酸萘酯酶活性在4齡幼蟲和蛹期與對照組相比顯著降低，而在2、3齡幼蟲和成蟲期與對照相比均無顯著差異。取食Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲的乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉移酶活性在各個發(fā)育時期與對照相比均無顯著差異。

2.2瓢蟲取食Bt玉米花粉時中腸蛋白酶活性的變化

從表2可以看出，與對照組相比，取食Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲的總蛋白酶和強堿性類胰蛋白酶活性在各個發(fā)育時期均無顯著差異。但取食Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲的弱堿性類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶活性在蛹期與對照組相比顯著降低，而在2、3、4齡幼蟲和成蟲期與對照組相比則無顯著差異。

表1 瓢蟲取食Bt玉米花粉和非Bt玉米花粉的主要代謝解毒酶活性比較

數(shù)據為平均值±標準誤，同行數(shù)據后附*表示差異顯著(Plt;0.05)。
Data in the lable are means±1S.E.,and those in the same row followed by * show significant difference atPlt;0.05.

表2 瓢蟲取食Bt玉米花粉和非Bt玉米花粉的中腸蛋白酶活性比較

數(shù)據為平均值±標準誤，同行數(shù)據后附*表示差異顯著(Plt;0.05)。
Data in the lable are means±1S.E.,and those in the same row followed by * show significant difference atPlt;0.05.

3 討論

有關轉基因植物對龜紋瓢蟲生長等方面影響的研究較多。李麗莉(2004)研究表明，龜紋瓢蟲取食在Bt玉米上繁殖的玉米蚜Rhopalosiphummaidis和表達CrylAb殺蟲蛋白的玉米花粉后未受到影響。Baietal.(2005)研究發(fā)現(xiàn)，取食轉cry1Ab基因水稻KMD1系花粉的龜紋瓢蟲雌成蟲壽命顯著低于取食親本花粉的龜紋瓢蟲，在KMD2系中新羽化的雄成蟲活性顯著低于親本；但兩者間的生長發(fā)育、存活和繁殖并無顯著差異。龜紋瓢蟲捕食了表達Cry1Ac蛋白轉基因抗蟲棉花上的棉鈴蟲后只是體重和體長減小，幼蟲的存活率、生長發(fā)育、死亡率、產卵和成蟲壽命都未受到影響(Zhangetal.,2006)。此外，捕食性瓢蟲可能會通過取食轉基因植物田中的害蟲而攝入Bt殺蟲蛋白(Obristetal.,2006)。還有研究表明，轉cry1Ac/cry1Ab基因棉花對龜紋瓢蟲幼蟲沒有直接的不利影響(Zhangetal.,2006)。

本研究結果表明，Bt玉米花粉對龜紋瓢蟲體內代謝解毒酶和中腸蛋白酶活性有一定的影響。取食轉Bt-cry1Ah基因玉米花粉的龜紋瓢蟲的α-乙酸萘酯酶、弱堿性類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶活性在蛹期顯著低于取食非Bt玉米花粉的龜紋瓢蟲，說明瓢蟲體內代謝解毒酶和中腸蛋白酶在與Bt殺蟲蛋白相互作用時可能會引起某些酶活性的變化，但個別酶活性的變化還不足以影響瓢蟲的生長發(fā)育。本試驗結果與表達Cry1Ab殺蟲蛋白的Bt玉米花粉對異色瓢蟲體內解毒代謝酶的影響(張永軍等，2005)相似。用表達Cry1Ac殺蟲蛋白的Bt棉花粉飼喂意大利蜜蜂Apismellifera后，蜜蜂體內代謝酶和一些消化酶的變化也未對其生長發(fā)育造成不利的影響(田巖等,2006)。有關轉Bt-cry1Ah基因玉米花粉對龜紋瓢蟲的潛在影響還需進一步研究。

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EffectsoftransgenicBt-cry1Ahmaize(ZeamaysL.)pollenontheactivityofdetoxificationenzymesandmidgutproteaseinPropylaeajaponica(Thunberg) (Coleoptera:Coccinellidae)

Lei CUI, Zhen-ying WANG, Kang-lai HE, Shu-xiong BAI

StateKeyLaboratoryfortheBiologyofthePlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193，China

The experiments were conducted in laboratory to explore the effects of transgenic. The activtiy changes of detoxification enzymes and midgut protease after feeding on the pollen of transgenicBt(Bt-cry1Ah) maize in the ladybird beetlePropylaeajaponica(Thunberg) was examined. The activities of the α-naphthylacetate esterase， acetylcholinesterase, glutathione-S-transferase, total protease, alkaline trysin-like proteinase and chymotrypsin-like proteinase in beetles rearedBtand non-Btmaize pollen were compared by feeding the on transgenicBt-cry1Ah maize pollen combinded with colorimetric method. The results indicated that there were no differences in the activities of acetylcholinesterase, glutathione-S-transferase, total protease and active alkaline trysin-like proteinase inP.japonicain any examined larval instars of larvae and adults fed on transgenicBtmaize pollen vs. those fed on nonBtpollen (the control). The activity levels of α-naphthylacetate esterase in 4th instar larvae and pupae, and the weak alkaline trysin-like proteinase and chymotrypsin-like proteinase inP.japonicaat pupae fed on transgenicBtmaize pollen were significantly lower in beetles feeding on transgenic pollen than that in the control. Therefore, the interation of the detoxification enzymes and midgut proteases and Cry1Ah protein may cause some of the enzymes activities. The potential impact of transgenicBt-cry1Ah maize pollen onP.japonicaneed to futher study.

transgenicBt-cry1Ah maize; pollen;Propylaeajaponica; detoxification enzyme; midgut protease; enzyme activity

2011-01-10接受日期2011-01-25

轉基因生物新品種培育科技重大專項(2008ZX08011-003)

王振營,E-mail：zywang@ippcaas.cn