Robert STEVENSON

在2004年的匹茲堡會議上，Waters公司(Milford,MA)介紹了一種能夠承受最高壓力為15 000 psi的ACQUITY UPLC色譜儀，從而導(dǎo)致生產(chǎn)色譜儀器的其他公司不得不加快步伐追趕。隨著他們的競爭，造成的后果包括引起憂慮、不確定性和懷疑(FUD)。然而直到2010年春季，市場上最大的7家供應(yīng)商每一家都才分別推出可以與之競爭的儀器，其中一些儀器的最大壓力超過5 000 psi。而對于使用者來說，受益是實(shí)實(shí)在在的，并且經(jīng)常帶來比預(yù)期更有價值的利益。很多關(guān)于銷售的爭論已經(jīng)拋諸腦后。因此，讓我們看看在七年之后UPLC會在未來帶來什么。

首先讓我們來看看使用者所認(rèn)知的來自超高效液相色譜(UHPLC)技術(shù)的好處。分析的速度和通量上的直接改進(jìn)是很明顯的，并且這是可以預(yù)期的結(jié)果，但是還有更多的好處。由于峰寬減小和標(biāo)準(zhǔn)分析柱的直徑減少(從4 mm到2 mm甚至到更小)，檢測靈敏度提高了好幾倍。大多數(shù)早期的儀器使用者，并沒有預(yù)見到由于工作流程和分析速度的改進(jìn)會使效率有很明顯的提高。用戶發(fā)現(xiàn)在很多情況下，接近實(shí)時或是實(shí)時的結(jié)果會幫助決策的制定。這在生產(chǎn)層面是決定性的。Waters公司很快就發(fā)展在過程層面上的ACQUITY，對象是擁有ACQUITY PATROLTM的實(shí)驗(yàn)室。盡管采用新技術(shù)和工作流程的程序設(shè)置比較慢，但是PATROL色譜儀正在迅速地得到關(guān)注，尤其是對醫(yī)藥品生產(chǎn)的支持。毫無疑問，美國食品和藥品管理局(PDA)主動推廣的過程分析技術(shù)(PAT)正在起著積極的作用。

人們通常關(guān)注的一個問題是：傳統(tǒng)方法能夠過渡到UHPLC上嗎？答案是依情況而定。如果這個方法包括等度洗脫，流速是通過與柱內(nèi)徑的比例簡單地下降，它保證了線性速率相同。通過柱長的變化比例減少運(yùn)行時間，同時還需要檢查數(shù)據(jù)系統(tǒng)通過比較臨界峰對之間的分辨率來處理窄峰的能力。在大多數(shù)情況下，所有上述情況非常簡單。最多也就是創(chuàng)建一個新的保留時間表。如果需要更高的可信度，可以對兩個儀器進(jìn)行可能一個月的平行實(shí)驗(yàn)，對結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果應(yīng)該是一致的。

對于梯度洗脫，系統(tǒng)死體積是不一樣的。例如，Agilent (Wilmington, DE)推出的Jet Weaver混合器有10到35 μL的死體積，其依賴于所混合體系的成分。這個死體積(混合)是大大小于1100系列液相色譜儀的死體積，所以梯度斜率比一般的(1100)混合器陡峭得多。大多數(shù)供應(yīng)商已經(jīng)實(shí)現(xiàn)通過計算機(jī)來轉(zhuǎn)換色譜方法，并且考慮到了流速設(shè)置的改變。DryLab(Molnar Institude,Berlin,Germany)也擴(kuò)展了這項(xiàng)功能，其中還包含耐用性評價。

盡管如此，如果構(gòu)建的方法不好，在過渡過程中可能就會有很大變化以至于需要新的研究來進(jìn)行確認(rèn)。實(shí)際上，Agilent已經(jīng)考慮到從1260和1290與更老型號儀器的連接程序包。例如，如果在Agilent 1100系列儀器上有一個經(jīng)過驗(yàn)證的方法，1290就能夠被“解調(diào)諧”給出與1100儀器相類似的性能。通過新舊儀器的比較，然后就能夠得到相應(yīng)的結(jié)果(保留時間和臨界峰對的分辨率)。通過在適當(dāng)?shù)奈恢脧?100連接到1290儀器平臺，就很容易通過改變方法達(dá)到利用1290儀器潛在性能的目的，或者更簡單的，只用一個梯度控制來減少其斜率。至少在一些情況下這種運(yùn)行模式的效果非常好。

另一個問題是：是否所有HPLC模式都能轉(zhuǎn)變到相應(yīng)的UHPLC。對于反相液相色譜(RPLC)是沒有任何問題的。因?yàn)镽PLC大約占了市場的三分之二，因此這是一個開始轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)。正相液相色譜，包括親水作用液相色譜(HILIC)，也可以進(jìn)行轉(zhuǎn)變。對于離子交換和體積排阻色譜的答案就沒有那么清楚的證明。一般的離子色譜應(yīng)該行得通，但是關(guān)于免試劑模式有很多的問題，在這里膜受到很高的壓力。膜的機(jī)械完整性是一個需要考慮的因素；除此之外壓力能引導(dǎo)滲透流到高濃度的一邊，這也是需要控制的。

超高壓帶來的樣品兼容性也是一個需要考慮的因素。超高壓對于小分子來說沒有什么關(guān)系，但是蛋白質(zhì)和聚集體在很高的壓力下結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化[1]。蛋白質(zhì)聚集體在2 000 bar的靜水壓下就能夠分解。對于其中一部分來說甚至在更低的壓力下就會開始裂解。進(jìn)一步說，蛋白質(zhì)的折疊也對壓力敏感。高靜水壓可以展開蛋白質(zhì)，因此暴露了其與三級結(jié)構(gòu)相關(guān)的疏水端。RPLC中的填料由于對疏水區(qū)域有親和作用，會改變蛋白質(zhì)解折疊的熱力學(xué)。更糟糕的是，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被送到柱內(nèi)，其構(gòu)型也會隨之變化。最高的壓力在柱的入口，如果壓力足夠高，蛋白可能開始解折疊，暴露了一般難以見到的與固定相相互作用疏水端，但是在出口附近，壓力小得多，這就允許蛋白質(zhì)部分或是全部地重新折疊。這種在柱內(nèi)的分析物構(gòu)型的改變，當(dāng)然會得到非理想形狀的色譜峰。通過在線快速搜索，我找不到任何關(guān)于高壓流動相在色譜分離過程中對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響的報告。盡管如此，如果高的壓力最后證明對于大蛋白質(zhì)的分離有一定影響，那么也許可以采用場流分離彌補(bǔ)其缺陷。

1 其他因素

短的柱壽命也是一個經(jīng)常關(guān)注的問題。用于UHPLC的柱子一般的定價是比傳統(tǒng)儀器上的柱子高20%或更高。通過比較用于UHPLC的一個2.1 mm內(nèi)徑的色譜柱和傳統(tǒng)儀器的一個類似固定相的4 mm內(nèi)徑的色譜柱，早期的對UPLC的質(zhì)疑指出UPLC柱子不像一般柱子具有很長的使用壽命。Waters公司對此的反擊是認(rèn)為這種情況可能只是偶然發(fā)生的，但是在其使用期限內(nèi)，UPLC柱子由于短的運(yùn)行時間所以可能會運(yùn)行了很多的樣品。因此，這兩種情況都可能是真的。我曾很有限地與一些UHPLC使用者交談，他們很少認(rèn)為柱壽命是UHPLC需要考慮的問題。

如果對于樣品來說，短的柱壽命是一個需要考慮的因素，那么一些供應(yīng)商建議用0.2 μm的濾膜過濾流動相和樣品。這會除去一般可能會堵住柱子的微粒。大多數(shù)的供應(yīng)商有用于過濾流動相的和樣品的配件。

配件是另一個需要考慮的因素。最初，配件是UPLC儀器中的一個很明顯的弱點(diǎn)。套管可能滑動，這將會導(dǎo)致管道拉回或是在極端情況下從配件中拉出。幸運(yùn)的是，后者是很少見的，但是套管的移動的確存在。不過柱效的損失是容易發(fā)現(xiàn)并彌補(bǔ)的。現(xiàn)在，一些廠商利用新的設(shè)計已經(jīng)解決了這個問題。Dionex公司(Santa Clara, CA)推出了這種ViperTM配件，它通過獨(dú)特的設(shè)計提供了一個可靠的連接。Optimize Technologies公司(Oregon City, OR)推出了一個新的雙套管，只需要用手?jǐn)Q緊就可以使其咬住管壁。

Shimadzu Scientific Instruments公司(Columbia, MD)介紹了一個在Nexera的HPLC進(jìn)樣器中所加入的新的omega流路，該流路保證了進(jìn)樣閥密封面的平整性。相對而言，傳統(tǒng)的設(shè)計對于系統(tǒng)壓力來說有三分之一在轉(zhuǎn)子密封處，但是其余的都在周圍。這可能使密封面傾斜和增加磨損，并最終導(dǎo)致滲漏。

2 花費(fèi)

許多人都受UHPLC的所承諾的性能吸引，但是它的成本如何？既使在這里，甚至在這一點(diǎn)上，改變也是顯而易見的。對于大多數(shù)人來說，這依賴于進(jìn)樣量。一個6 000 psi的儀器和一個UHPLC儀器，它們的價格差別在40%到100%左右。但是Dionex的Frazer McLeod聲稱[2]，其通量上的效率增加了10倍。通常來說，效率的提高是決定于進(jìn)樣量。一般來說，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室需要更高的分析容量時，就要增加一套HPLC。一次性增加10倍通量是很少見的。但是如果你有這樣一套UHPLC儀器，花費(fèi)是很少的和引人注目的。一套UHPLC儀器比10套傳統(tǒng)的色譜儀器要便宜得多。

PerkinElmer (PE, Shelton, CT)公司的Eric Denoyer博士對PE公司不同儀器間的對比經(jīng)濟(jì)學(xué)分析表格進(jìn)行了討論，涉及的儀器主要是PE改進(jìn)的Flexar FX-10 (10000psi)、FX-15 (15000psi)HPLC系統(tǒng)和一般的HPLC系統(tǒng)如PE200系列HPLC[3]。實(shí)驗(yàn)室在幾個月之內(nèi)得到進(jìn)樣量的回報證明相對于其增加的成本是值得的。

同時PE公司的分析節(jié)省了溶劑，但似乎忽略了實(shí)驗(yàn)室空間的消耗。工作臺所需要的空間一般是非常缺乏的，而且十分昂貴的。UHPLC的高通量特點(diǎn)可能會代替一些傳統(tǒng)儀器，從而為其他的工作騰出了空間。Dionex公司推出了一個雙梯度的方法，它與單個梯度的覆蓋區(qū)域是類似的。

另外一種情況是如果HPLC儀器使用很少并且從來不運(yùn)行到它的檢出限，那么通過對成本分析建議使用傳統(tǒng)的系統(tǒng)(6 000psi)。制備色譜，甚至是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，可能一直傾向于使用常規(guī)HPLC技術(shù)來進(jìn)行分離純化。

3 UPLC往何處去？

UPLC的未來怎么樣呢？UPLC的發(fā)展是通過柱技術(shù)推動的。如果我們接受更高的壓力，那么可以使用更長的柱子，以得到更高的峰容量，這對于分離來說是有用的。當(dāng)然，可以放棄使用小粒徑的填料(比如說10 μm的填料)而制作長的柱子以達(dá)到高峰容量，但是太長的運(yùn)行時間并不符合我們的要求。有趣的是，需要高峰容量的樣品的數(shù)量是非常少的，至少在今天看來。并且比起簡單地使用長的柱子，多維液相色譜可能是一個更加有效地增加峰容量的途徑。

減少柱子填料的粒徑是另一種選擇。然而，在工程上會遇到很大的挑戰(zhàn)，比如說流動相的壓縮。我們已經(jīng)知道大概三分之一的泵沖程被用于壓縮流動相到20 000 psi。現(xiàn)今的脈沖阻尼器(機(jī)械上和電氣上的)是非常有效的，但是往復(fù)式計量泵在運(yùn)行的時候會達(dá)到臨界的狀態(tài)。因此，最大壓力的增加可能將需要一個不同的泵技術(shù)，也許是小體積注射泵。

就個人而言，我對UHPLC接下來10年改進(jìn)的期望：由于色譜儀器產(chǎn)品壽命周期是大約10年，下一代的UHPLC應(yīng)該在1或2年之內(nèi)開始出現(xiàn)。我期待的改進(jìn)是最大壓力將會慢慢的增加到35000 psi左右。泵在最高壓力工作的能力也會導(dǎo)致流速范圍的增加。我們發(fā)現(xiàn)最小尺寸在1.4~2 μm的柱填料在10年內(nèi)都會比較實(shí)用。由于在30 000 psi左右的情況下需要避免摩擦熱的產(chǎn)生，柱直徑將會優(yōu)化小于1 mm。預(yù)填充柱長度的選擇將會變長。盡管如此，不同于現(xiàn)今通過對柱的需求來帶動它的發(fā)展，這些改進(jìn)將會給柱子帶來新的應(yīng)用。這是一段艱苦的路程。

總而言之，Waters公司因抓住了機(jī)遇受到贊賞，用UPLC技術(shù)將HPLC帶到一個新的水平。在大約40 000 psi提高150%的性能對于開啟新領(lǐng)域研究來說其價值并不明顯。似乎更可能地是工程師在下一個或兩個產(chǎn)品周期將會集中提高(臨界狀態(tài))的性能。隨著單位體積和工程經(jīng)濟(jì)學(xué)的改進(jìn)，花費(fèi)將會降低。

[1] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC113776/.

[2] McLeod, F.UHPLC + Solutions from Dionex.Lecture in Webinar, Nov 18, organized by Lab Manager; http://www.labmanager.com/articles.asp?ID=817.

[3] Denoyer, E.UHPLC + Solutions from Dionex.Lecture in Webinar, Nov 18, organized by Lab Manager; http://www.labmanager.com/articles.asp?ID=817.