陳麗紅，楊凌輝

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島266021;2中國人民解放軍第401醫(yī)院)

目前，甲狀腺功能減退癥(甲減)的主要治療方法是甲狀腺激素替代治療、異體或異位成體甲狀腺移植、胎兒甲狀腺供體移植和甲狀腺細(xì)胞替代治療等，但均有局限性。近年研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞(ESCs)經(jīng)胚胎體發(fā)育階段，在特定條件下可定向分化為甲狀腺細(xì)胞［1］，為ESCs源性甲狀腺細(xì)胞替代治療甲減提供依據(jù)?，F(xiàn)結(jié)合文獻(xiàn)就干細(xì)胞(SC)移植治療甲減的研究進(jìn)展綜述如下。

1 SC及SC分化

SC是一類具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞，能產(chǎn)生表型與基因型完全相同的子細(xì)胞，是機(jī)體其他細(xì)胞的起源［2］。根據(jù)其分化潛能分為4類:①全能干細(xì)胞:具有自我更新并能分化為任何類型組織細(xì)胞的能力，如受精卵和ESCs。②多能干細(xì)胞:屬分化方向確定的SC，如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等。③定向祖細(xì)胞:是多能干細(xì)胞分化的下游細(xì)胞，其分化和自我維持、自我更新能力受限，如造血祖細(xì)胞。④專能干細(xì)胞:只能向某一類型的細(xì)胞分化，如神經(jīng)前體細(xì)胞。但是如何誘導(dǎo)SC分化為期待的組織或細(xì)胞，是目前SC研究領(lǐng)域的重要環(huán)節(jié)。ESCs是從著床前囊內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或早期胚胎原始生殖嵴的胚胎生殖細(xì)胞分化出來的全能干細(xì)胞，是胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)，具有無限增殖、自我更新和多向分化能力。在有飼養(yǎng)層或抑制因子存在的條件下，ESCs能保持未分化狀態(tài)，一旦去除這些分化抑制因素或添加某些誘導(dǎo)分化因子，就可向某些細(xì)胞分化。目前，關(guān)于甲狀腺SC的誘導(dǎo)分化主要集中在ESCs。

2 ESCs體外誘導(dǎo)分化為甲狀腺細(xì)胞

甲狀腺SC移植的關(guān)鍵是將ESCs定向誘導(dǎo)為甲狀腺細(xì)胞。以前獲得甲狀腺細(xì)胞的方法是依賴體外培養(yǎng)人或鼠的甲狀腺細(xì)胞系—FRTL-5細(xì)胞株［3］。因其培養(yǎng)物中經(jīng)?；祀s其他類型的細(xì)胞，導(dǎo)致培養(yǎng)純度降低，故不能作為較純的甲狀腺細(xì)胞來源。隨著ESCs誘導(dǎo)造血細(xì)胞、神經(jīng)及心肌細(xì)胞等成功，Lin等［4］開始了ESCs定向誘導(dǎo)分化成甲狀腺細(xì)胞的研究。

2.1 ESCs體外誘導(dǎo)分化的方法 在體外，ESCs因某些分化抑制因子存在，如成纖維滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的分化抑制因子等，不能自動定向分化［5］，保持未分化狀態(tài);而維甲酸、二甲基亞砜、六亞甲基乙酰胺及神經(jīng)生長因子等則可定向誘導(dǎo)ESCs分化。Lin等將ESCs置于DMEM培養(yǎng)基中，并采用15%胎牛血清培養(yǎng)，用1%白血病抑制因子抑制其分化;得到擬胚體(EB)后，用15%胎牛血清、0.5 mg/ml抗壞血酸及1.5×10－4mol/L硫代甘油培養(yǎng)，最終隨著 EB成簇生長，ESCs也不斷生長，證明ESCs在某些誘導(dǎo)因子作用下能定向分化。因各誘導(dǎo)因子只能誘導(dǎo)唯一的細(xì)胞類型，且其誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，故在誘導(dǎo)ESCs分化時帶有一定的盲目性。

2.2 ESCs體外誘導(dǎo)分化為甲狀腺細(xì)胞的研究現(xiàn)狀 Lin等［6］將野生小鼠胚胎干細(xì)胞CCE株誘導(dǎo)分化為甲狀腺細(xì)胞樣細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)ESCs發(fā)育6 d的EB在基因表達(dá)上與正常甲狀腺濾泡細(xì)胞均可檢測到成對框基因8、Na+/I－同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)、甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶和促甲狀腺激素(TSH)受體，表明該胚體具有甲狀腺功能。為提高ESCs分化期間產(chǎn)生甲狀腺細(xì)胞的比例，通過研究產(chǎn)生了一種TSH受體啟動子［7］，在其控制下，可追蹤攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(GFP)—新霉素雙抗ESCs在體外分化期間甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生的GFP表達(dá)。GEP陽性細(xì)胞是依賴于ESCs的衍生胚體，如果前2～4 d分化期間使用促甲狀腺激素處理，則GFP陽性細(xì)胞比例明顯增加。這些由ESCs衍生的GEP陽性細(xì)胞輔以TSH的無血清環(huán)境基質(zhì)膠中，形成甲狀腺濾泡樣細(xì)胞群［8］。免疫熒光研究證實(shí)，在細(xì)胞群中有共區(qū)域化帶有NIS的TSH受體，且NIS在質(zhì)膜中可專門表達(dá)。此外，在這些細(xì)胞中可觀察到I－攝取活動。此標(biāo)志著由ESCs分化為甲狀腺濾泡細(xì)胞成功。

因不同物種的ESCs在某些細(xì)節(jié)上分化不同，故其用于人類ESCs尚需驗(yàn)證。人類ESCs分化形成內(nèi)胚葉，類似于脊椎動物在體內(nèi)原腸胚形成期間發(fā)生的內(nèi)胚葉分化。隨后，這些人類內(nèi)胚葉細(xì)胞可在一定條件下分化為更成熟的內(nèi)胚層器官細(xì)胞［9］。因甲狀腺濾泡細(xì)胞產(chǎn)生于脊椎動物生長期間的內(nèi)胚葉細(xì)胞中，故采用類似方法可能用來刺激人類ESCs分化形成甲狀腺濾泡細(xì)胞。雖然確切的必要培養(yǎng)條件尚未確定，但這些研究無疑幫助我們發(fā)現(xiàn)甲狀腺細(xì)胞分化的機(jī)制。

2.3 人體甲狀腺中存在成人SC的證據(jù) 目前發(fā)現(xiàn)，成人SC存在于人的骨髓、肝臟、胰臟和腦組織中。Thomas等［10］研究SC Oct-4表達(dá)和人類甲狀腺中最初單獨(dú)培養(yǎng)的內(nèi)胚層GATA-4、HNF-4時發(fā)現(xiàn)，在某些甲狀腺癌細(xì)胞中可檢測到Oct-4表達(dá)，而非GATA-4表達(dá)，說明人類甲狀腺中存在成人SC和內(nèi)胚層前體細(xì)胞。這些研究將為評估甲狀腺SC是否可能有效地治療甲減提供參考依據(jù)。

3 LSC再生治療的臨床應(yīng)用價值

ESCs本身有很強(qiáng)的自我更新和定向分化能力，其不但對研究甲狀腺細(xì)胞的分化提供了研究模型，而且為甲狀腺基因振作與分析提供了大量細(xì)胞來源。通過EB中的甲狀腺多能干細(xì)胞研究，最終使我們更好地理解甲減等疾病，同時ESCs作為甲狀腺濾泡細(xì)胞的更新來源，使甲狀腺替代治療成為可能。如果使用細(xì)胞替代療法進(jìn)行移植治療，必須滿足以下條件:第一，胚胎或成人SC的前體細(xì)胞必須確定能夠在體外擴(kuò)增到大批成熟，以替代甲狀腺細(xì)胞;第二，這些替代細(xì)胞必須能夠合成甲狀腺球蛋白，具有運(yùn)輸?shù)狻⒌饣锖图谞钕偾虻鞍椎哪芰?，并且能在生理上以適當(dāng)?shù)姆绞絻Υ婧歪尫偶谞钕偌に?第三，必須能夠嚴(yán)格控制細(xì)胞增殖的能力，以避免移植細(xì)胞后發(fā)展為甲狀腺功能亢進(jìn)癥。

4 問題和展望

最近SC的研究有兩個重大的技術(shù)突破，一是人類ESCs在體外培養(yǎng)成功;二是成體SC橫向分化。這表明成體SC在一定微環(huán)境作用下，可橫向分化為需要的細(xì)胞和組織，起到有效的治療作用。目前，將ESCs定向誘導(dǎo)分化成甲狀腺細(xì)胞的研究較少，今后可使用懸浮法將ESCs誘導(dǎo)分化成EB，在合適的培養(yǎng)條件下，通過EB定向分化成甲狀腺細(xì)胞，通過EB中的甲狀腺多能干細(xì)胞對甲狀腺的發(fā)生、發(fā)育進(jìn)行詳細(xì)的分子水平研究，最終了解甲減等疾病的發(fā)病機(jī)理。同時，可將ESCs作為載體細(xì)胞，利用ESCs的可塑性將其與自身甲狀腺結(jié)合，將不同的基因信號導(dǎo)入ESCs中，使其在抑制部位表達(dá)，為細(xì)胞替代治療結(jié)合基因治療開創(chuàng)可觀的前景。

總之，目前對ESCs的研究尚存在倫理學(xué)方面的爭議，以及其自身特征不確定等問題，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果能否用于人體尚存爭議。因此，積極探索成體SC的定向誘導(dǎo)作為甲狀腺濾泡細(xì)胞的更新來源具有重要意義。

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