楊志甫，王麗珍 ，孟祥君，張茂林，席富強

(1包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014010;2包頭醫(yī)學院病理教研室)

腦梗死是腦血管病中最常見者，發(fā)病率占腦血管疾病發(fā)病率的70% ～80%。研究證明，雌激素的血管保護作用主要是通過與雌激素受體α(ER-α)結(jié)合而介導的［1］。高同型半胱氨酸血癥已被確立為腦梗死的獨立危險因子［2］，但是有關(guān)其誘發(fā)腦梗死的機制尚未完全闡明。近年研究顯示，高同型半胱氨酸血癥也可能干擾基因的甲基化修飾進而引起某些基因的表達異常來促進疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究從臨床整體角度來探討高同型半胱氨酸血癥是否可通過干擾ER-α基因啟動子區(qū)甲基化修飾，引起基因表達改變來促進腦梗死的發(fā)生發(fā)展，從而為腦梗死的預防和治療提供新的思路和啟示。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年9月～2011年2月在本院住院的腦梗死患者106例(腦梗死組)，均符合第四屆全國腦血管病會議修訂的標準并經(jīng)CT或MRI檢查證實。男69例、女37例，年齡41～84(63.54±11.36)歲。排除意識障礙或存在嚴重合并癥而不能完成檢查及神經(jīng)功能評定的患者、心源性腦栓塞患者、存在嚴重肝病或感染者、嚴重營養(yǎng)不良或合并有免疫性疾病者。47例健康對照(對照組)來源于我院體檢科，其中男30例、女17例，年齡39～82(60.06±11.67)歲。兩組年齡、性別有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1 ER-α基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測 抽取受試者清晨空腹肘靜脈血2 ml，抽提基因組DNA按照TIANGEN公司試劑盒提供的方法進行。然后進行基因組DNA的亞硫酸氫鈉修飾及純化，按照Promega公司A7280 DNA純化試劑盒提供的方法進行，純化后的DNA置－20℃保存?zhèn)溆?。參考智艷芳等［3］方法，針對ER-α基因啟動子區(qū)及第一外顯子區(qū)CpG島的序列完全甲基化和完全非甲基化兩種情況，使用primers設計出ER-α基因甲基化特異性引物(ER-pM)和非甲基化特異性引物(ER-pU)。還需在ER-pM、ER-pU的外側(cè)選擇不含CG的區(qū)域設計一對外圍引物，將修飾后的DNA進行第一輪擴增后再分別用ER-pM和ER-pM進行第二次擴增。引物由Invitrogen公司上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

巢式甲基化特異性PCR引物序列:巢式外圍引物 ER-PN:上游:5'-GAGGTGTATTTGGATAGTAG-3'，下游:5'-AACTCCCTAAACTCTCCCTT-3'，擴增長度422 bp。ER-α甲基化引物:上游:5'-CGTCGTGTATAATTATTTCGAGGGC-3'，下游:5'-CTCGCGCACCGTATAACCGATAAAC-3'，擴增長度 283 bp;ER-α非甲基化引物:上游:5'-TGTTGTGTATAATTATTTTGAGGGT-3'，下游:5'-CTCACACACCATATAACCACTAAAC-3'，擴增長度 283 bp。反應體系:12.5 μl，第一輪使用外圍引物ER-PN進行擴增，其中含有經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾的 DNA 2 μl、Taq 酶0.5 μl、反應液10 μl，第二輪分別使用ER-pM和ER-pU進行擴增，模板為第一輪擴增后產(chǎn)物 2 μl、Taq 酶0.5 μl、反應液10 μl。反應條件:應用 Touchdown-PCR進行擴增，第一輪PCR:94℃預變性5min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸lmin，以后每個循環(huán)退火溫度降低1℃，經(jīng)20個循環(huán)后退火溫度降至45℃;94℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸 lmin，20個循環(huán);72℃延伸7min。以第一輪PCR產(chǎn)物2 μl為模板，分別使用ER-pM和ER-pU進行第二輪擴增，同樣用 Touchdown-PCR，條件同第一輪。取 6 μl PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.2.2 同型半胱氨酸(tHcy)的檢測 采用熒光生化法檢測血tHcy濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件，計量資料以±s表示，正態(tài)分布計量資料組間均數(shù)比較采用t檢驗;計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;相關(guān)性分析采取Spearman秩相關(guān)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死患者血Hcy濃度與ER-α基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的相關(guān)性 腦梗死組tHcy濃度為(16.18 ± 6.06)μmol/L，對照組為(9.61 ± 3.12)μmol/L，前者明顯高于后者(t=7.019，P=0.00)。在腦梗死組，ER-α基因啟動子區(qū)未發(fā)生甲基化的腦梗死患者38例 tHcy濃度為(12.14±3.48)μmol/L，46例半甲基化的腦梗死患者為(15.86±3.56)μmol/L，22例全甲基化的腦梗死患者為(23.83±6.65)μmol/L。將腦梗死患者ER-α基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)和tHcy濃度進行Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示，兩者呈高度正相關(guān)(r=0.733，P=0.00)。

2.2 兩組ER-α基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的比較腦梗死組有68例發(fā)生了甲基化，其中完全甲基化22例、半甲基化46例，甲基化率為64.2%;對照組有10例發(fā)生了甲基化，其中完全甲基化3例、半甲基化7例，甲基化率為21.3%。腦梗死組甲基化發(fā)生率顯著高于對照組(χ2=22.27，P=0.00)。

3 討論

腦梗死是腦血管病中最常見者，探討腦梗死的發(fā)病機理，制定有效預防及治療措施是當今醫(yī)生和學者的重要任務。Leno等研究發(fā)現(xiàn)，女性卒中危險性低于男性，但在絕經(jīng)后幾年這種差異消失。Dubal等動物實驗表明，雌性動物缺血后腦損害較雄性動物輕，這種現(xiàn)象隨雌性動物衰老和內(nèi)源性卵巢激素的去除而消失。這些研究均提示雌激素有腦保護作用。而雌激素的腦血管保護作用是通過雌激素進入細胞后與受體結(jié)合，形成激素—受體復合物，再進入細胞核，誘導功能不同的蛋白質(zhì)合成來發(fā)揮的。與雌激素結(jié)合的受體包括ER-α和ER-β兩種，體外實驗已證明雌激素的血管保護作用主要是通過與ER-α 結(jié)合介導的［4］。

Hcy作為一種非蛋白質(zhì)組成氨基酸，系各種轉(zhuǎn)甲基代謝(包括DNA的甲基化修飾)的甲硫氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。既然Hcy是甲硫氨酸循環(huán)的重要一環(huán)，其異常升高則很可能影響DNA的甲基化過程，并進而影響某些基因的表達而促進疾病的發(fā)生發(fā)展。大量研究表明，高同型半胱氨酸血癥是腦卒中發(fā)生的一個重要危險因素。它是否會導致包括ER-α基因在內(nèi)的很多功能基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化修飾，從而使基因表達沉默，進一步導致腦梗死，本文進行了相關(guān)探討。

本研究結(jié)果顯示，腦梗死患者ER-α基因啟動子區(qū)甲基化率明顯高于對照組，且腦梗死患者ER-α基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)和tHcy濃度呈高度正相關(guān)，提示高同型半胱氨酸血癥可能通過對ER-α基因表達調(diào)控區(qū)的甲基化修飾而降低雌激素的腦保護作用，從而導致腦梗死發(fā)病，這可能是高同型半胱氨酸血癥作為腦梗死獨立危險因素的又一機制。對于雌激素水平正常的絕經(jīng)期前的女性腦梗死患者，是否ER-α基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化致雌激素表達下降更有意義，有待于進一步深入研究。

［1］Babilcer FA，De Windt LJ，Van EM，et al.Estrogenic hormone action in the heart:regulatory network and function［J］.Cardiovasc Res，2002，53(3):709-719

［2］Coll BMM，Malionow MR，Beamer N，et al.Hyper homocysteinemia as a risk factor for occlusive vascular disease［J］.Stroke，1990，21(3):572-576.

［3］智艷芳，黃彥生，李著華，等.動脈粥樣硬化病人雌激素受體α基因甲基化與高同型半胱氨酸血癥關(guān)系的研究［J］.衛(wèi)生研究，2008，37(3):314-317.

［4］Huang YS，Peng KJ，Wang SR，et al.Different effects of homocysteine and oxidized low density lipoprotein on methylation status in the promoter region of the estrogen receptor gene［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2007，39(1):19-26.