摘 要 建立了毛細管區(qū)帶電泳技術(shù)快速測定D1蛋白酶活性及其抑制劑先導化合物的篩選方法。實驗選用未涂層熔融石英毛細管（43 cm 和磷酸鹽緩沖溶液（50 mmol/L， pH 3.0）作為分離介質(zhì)，運行電壓18 kV，測定了D1蛋白酶的活性并對部分抑制劑先導化合物進行了篩選。結(jié)果表明， ITP26和ITP21兩種異GFDA1唑噻唑哌啶類先導化合物對蛋白酶活性具有抑制作用，抑制率分別為26%和13%。

關(guān)鍵詞 D1蛋白酶； 毛細管區(qū)帶電泳； 活性； 先導化合物

1 引 言

D1蛋白酶（D1 C-terminal processing protease， CtpA）是由葉綠體核ctpA基因編碼、含有389個氨基酸殘基的單亞基蛋白，分子量約為45 kDa，廣泛存在于各種生物體中[1]。其作用主要是通過剪切D1蛋白前體C端延伸的肽段，促使其轉(zhuǎn)化成具有活性的D1蛋白，用于光合系統(tǒng)II中錳簇復(fù)合物的組裝，是植物進行光合作用所必須的步驟，因此D1蛋白酶被認為是一種新型優(yōu)異的廣譜除草劑作用靶標[2]。

開發(fā)以D1蛋白酶為靶標的新型農(nóng)藥，首先需要獲得具有生物活性的重組蛋白酶和選擇合適的先導化合物抑制活性篩選方法。D1蛋白酶活性檢測通常采用兩種方法：一是采用前體蛋白作為反應(yīng)底物，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 遷移檢測反應(yīng)產(chǎn)物[3]；二是以合成的D1 前體蛋白剪切位點附近的肽段作為反應(yīng)底物，剪切后的肽段采用高效液相色譜（HPLC）進行分離和檢測[4]。前者凝膠遷移法準確度較低，不適合大規(guī)模操作；后者的準確度較高，但由于采用高效液相色譜法，分析過程耗時較多，也不適合快速和高通量篩選的要求。毛細管電泳（CE）具有靈敏度高、環(huán)境污染少、進樣量小、樣品不需前處理、操作簡單等優(yōu)點，在生物工程、藥物分析和檢測等領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用，可用于多肽分離和蛋白質(zhì)的分析[5～7]。本研究采用毛細管區(qū)帶電泳建立了重組D1蛋白酶生物活性的測定方法，并用于抑制劑先導化合物篩選。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑P/ACE MDQ 型毛細管電泳儀（美國Beckman-Coulter公司）；熔融石英毛細管柱（河北永年銳灃色譜器件公司，50 cm 有效長度43 cm）；KTA purifier 100 蛋白純化系統(tǒng)（GE Healthcare， 美國）。9肽（9P， AIEAPSTNG）、24肽（24P， VMHE RNAHNFPLDLAAIEAPSTNG）均由上海吉爾生化公司合成；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，北京鼎國生物技術(shù)有限公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2 實驗方法

2.2.1重組蛋白酶的表達和純化 D1蛋白酶的表達和純化參照文獻 [8]的方法，將純化得到的蛋白溶液超濾濃縮，采用HiTrap脫鹽柱除去咪唑，進行SDS-PAGE電泳鑒定和分析。

2.2.2 毛細管電泳分離條件的選擇 毛細管電泳分離選用磷酸鹽緩沖液，以未涂層的石英毛細管為分離柱（有效長度43 cm，內(nèi)徑75 上清液進行毛細管電泳分析，以多肽峰面積確定酶活性大小。進行抑制劑先導化合物的篩選時，酶溶液和待測化合物（DMSO溶解）混合后首先在25 ℃恒溫水浴中放置30 min，使二者充分結(jié)合，然后進行酶活性的測定。分別以緩沖液和DMSO代替化合物溶液作為陰性對照和陽性對照，根據(jù)24肽吸收峰面積的變化計算抑制率。

3 結(jié)果與分析

3.1 D1蛋白酶的表達和純化

為了獲得具有較高生物活性的重組D1蛋白酶，對表達條件進行優(yōu)化，通過選擇降低誘導劑的使用濃度和誘導溫度，獲得了可溶性表達的重組蛋白酶。采用親和層析法純化得到的蛋白酶純度可達到95%以上（圖1），比活力為1.10

為文獻[9]的15倍，可用于毛細管電泳分析。

3.2 電泳分離條件的優(yōu)化

3.2.1 緩沖液pH值對分離的影響 運行緩沖液pH值在2～10范圍內(nèi)對多肽保留時間影響的結(jié)果如圖2所示。在pH值6～8范圍內(nèi)，兩種多肽達不到完全分離的要求。將pH值提高至9～10時，化合物的保留時間有所差別，但差別較小。而將pH值降低至2～5后，兩種小肽的分離度增大。其原因是高pH值條件下， 毛細管柱內(nèi)壁表面的硅羥基發(fā)生電離， 其表面負電荷密度增加， 導致電滲流增大，縮短了待測物的出峰時間。隨著pH值的降低， 硅羥基的電離受到抑制， 電滲流也相應(yīng)降低。當pH＜3后， 質(zhì)子化作用使得電滲流趨于零， 此時pH值的改變對電滲流的影響較小[10]。本實驗確定最適pH值為3。

3.2.2 緩沖液濃度對分離的影響 緩沖液濃度為20和30 mmol/L時，兩種多肽的遷移時間較短，分離度較低，峰形較寬（見圖3）。濃度增大至50 mmol/L時，多肽的遷移時間增大，但譜峰變得較為尖銳，分離度也相應(yīng)提高。其原因在于增大緩沖液濃度后， 溶液的離子強度增加，毛細管內(nèi)壁的雙電層壓縮，減小了電滲流， 待測物的遷移速度降低， 遷移時間增加。 增大緩沖液的濃度可以減弱樣品之間以及樣品與毛細管壁間的相互作用， 從而減少譜帶變寬， 提高分離效率[11]。但當濃度進一步增大到高于50 mmol/L時，會導致焦耳熱升高，反而使得譜帶變寬，并產(chǎn)生一些雜峰。本實驗中緩沖液濃度選擇為50 mmol/L。[TS（] 圖3 運行緩沖液濃度對多肽分離度的影響

3.2.3 分離電壓和進樣時間的選擇 實驗結(jié)果表明，隨著分離電壓的升高，電滲流增大，樣品遷移時間縮短。運行電壓繼續(xù)增大后，過量的焦耳熱不能有效散發(fā)，從而形成徑向溫度梯度[12]，使得基線噪音增大，出現(xiàn)過多的干擾峰，導致分離度降低。但采用較小的分離電壓，不僅使得分離時間延長，也會降低分離度。因此確定的最佳分離電壓為18 kV。此外，如果進樣時間較短，樣品的峰面積較小，重現(xiàn)性也較差，會產(chǎn)生較大的分析誤差；延長進樣時間，雖然可以增加檢測的靈敏度，但由于樣品超載，造成進樣區(qū)帶擴展，從而導致樣品峰出現(xiàn)變寬、拖尾等現(xiàn)象。最終確定最佳進樣時間為10 s。

3.3 D1蛋白酶活性的測定及其抑制劑先導化合物的篩選

以合成的D1前體蛋白羧基端延伸的24肽作為模擬底物，采用毛細管電泳法測定了D1蛋白酶的生物活性，所得結(jié)果如圖4所示。蛋白酶水解24肽后生成相應(yīng)的9肽和15肽，反應(yīng)后24肽對應(yīng)的吸收峰高明顯降低，同時在17.7 min處出現(xiàn)一個新的吸收峰，經(jīng)過對照確認為9肽。此外，在16 min位置還出現(xiàn)了一個小的吸收峰，推測可能為生成的15肽。根據(jù)24肽反應(yīng)前后吸收峰面積的變化可知其被水解了43%，與高效液相色譜法測定的活性較為接近。

從圖4可見，在反應(yīng)體系中加入蛋白酶后，24肽和9肽的遷移時間以及兩者的間隔明顯增大，吸收峰也變寬。其原因在于加入高濃度的蛋白質(zhì)分子后，蛋白質(zhì)與毛細管壁產(chǎn)生吸附效應(yīng)，使電泳區(qū)帶增寬，導致吸收峰的拖尾和變形。此外，高濃度蛋白質(zhì)的加入還改變了緩沖液的粘度以及與毛細管壁發(fā)生了作用[13]，影響了電滲流，從而導致24肽與9肽的遷移時間增大和吸收峰變寬。

抑制劑先導化合物對D1蛋白酶抑制活性的測定結(jié)果如圖5所示。由于先導化合物的溶解性較差，僅溶于二甲亞砜（DMSO），考察了DMSO對D1蛋白酶活性的影響。從圖5可見，少量 DMSO的加入對蛋白酶的活性影響很小，因此可以忽略溶劑對酶活性測定的影響。當?shù)鞍酌概c先導化合物ITP21作用后，發(fā)現(xiàn)其具有較明顯的抑制作用，24肽對應(yīng)的吸收峰較未加入化合物體系的24肽吸收增高，而9肽和15肽對應(yīng)的吸收峰消失，證實了毛細管電泳法對先導化合物抑制活性進行測定的可行性。

分別測定了19個先導化合物對D1蛋白酶的抑制活性，結(jié)果表明，兩種異噁唑噻唑哌啶類先導化合物ITP21和ITP26對D1蛋白酶具有一定程度的抑制作用，其抑制率分別為21%和13%，其它先導化合物對蛋白酶的抑制活性不明顯。本方法簡便、快速、靈敏度高，可用于D1蛋白酶抑制劑先導化合物篩選。

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Abstract Capillary zone electrophoresis （CZE） with UV detection has been used for the determination of D1 protease activity and screening for lead compounds of inhibitor. Separation conditions of peptides were optimized as phosphate buffer （50 mmol/L， pH 3.0） at 18 kV running voltage， with capillary length of 43 cm