秦勝利 ，于建生

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266042)

酶固定化技術(shù)研究進(jìn)展

秦勝利 ，于建生

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266042)

酶的固定化技術(shù)是酶工程領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一，本文闡述了傳統(tǒng)的酶固定化技術(shù)，并對(duì)定向固定、多酶共固、新型載體等前沿技術(shù)做了介紹，另外還對(duì)固定化酶的應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

酶的固定化;定向固定 ;新型載體

Abstract:Enzyme immobilization technique is the key and hotspots research field in enzyme engineering.The traditional enzyme immobilization technique are introduced，the oriented immobilization，co － immobilization of multienzyme，new carrier and so frontier technologies are introduced，in addition to，the immobilized enzyme application prospect and development trend are predicted.

Key words:enzymes immobilization;oriented immobilization;new vectors

當(dāng)前，游離酶的催化技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，但由于其穩(wěn)定性差、易失活、在非水溶液中不溶解、反應(yīng)后酶無法回收利用等缺點(diǎn)，使其無法充分應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。在此情況下，固定化酶應(yīng)運(yùn)而生，酶的固定化是指將酶限制或固定在某一局部空間或特定的固體載體上進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)利用的技術(shù)，在催化反應(yīng)中以固相狀態(tài)作用于底物［1］。目前，固定化酶技術(shù)已應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)分析、環(huán)保技術(shù)、三廢處理等領(lǐng)域，并取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益。

1 傳統(tǒng)的酶固定化方法

傳統(tǒng)的酶固定化有四種方法:吸附法(非共價(jià)結(jié)合吸附法和離子結(jié)合吸附法)、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法(網(wǎng)格包埋法和微囊包埋法)。

1.1 吸附法

吸附法是固定化方法中最簡(jiǎn)單的一種，它是通過載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵非共價(jià)結(jié)合而達(dá)到固定化酶目的的方法，由于酶和載體間的作用力較弱，因此吸附法酶活損失很少。

1.2 共價(jià)結(jié)合法

共價(jià)結(jié)合法是通過酶的活性非必需須側(cè)鏈基團(tuán)與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的方法，又稱共價(jià)偶聯(lián)法。其優(yōu)點(diǎn)是酶與載體結(jié)合牢固，得到的固定化酶穩(wěn)定性好，一般不會(huì)因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落，是目前應(yīng)用和報(bào)道最多的一類方法。

1.3 交聯(lián)法

交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，交聯(lián)法可以不通過載體，只通過酶之間的相互交聯(lián)，即可形成一種復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。交聯(lián)法一般作為其他固定化方法的輔助手段［2］。

1.4 包埋法

包埋法是將酶或細(xì)胞，通過物理學(xué)方法固定在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的方法。包埋時(shí)條件溫和，一般不會(huì)引起酶高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，酶活回收率較高，只適合于小分子底物與產(chǎn)物的生物催化反應(yīng)。

2 固定化技術(shù)研究新進(jìn)展

2.1 定向固定

定向固定化是把酶和載體在酶的特定位點(diǎn)上連接起來，使酶在載體表面按一定的方向排列［3］。酶定向固定化的設(shè)計(jì)是在背離活性中心入口的酶表面通過定點(diǎn)突變?cè)谠撁副砻嬉氲皖l氨基酸(半胱氨酸)，通過該氨基酸殘基的特殊側(cè)鏈來控制固定化方向。Viswanath［4］等用特定位點(diǎn)基因突變法將枯草桿菌蛋白酶的一個(gè)絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?，然后定向固定在聚砜載體上，定向固定化的酶的活性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于隨意固定化的酶。Stovickova等［5］將胰蛋白酶通過豬多克隆抗體定向法固定在Sepharose 4B載體上，發(fā)現(xiàn)定向固定化酶的活性與天然胰蛋白酶的活性接近。目前，這種有序的、定向固定化技術(shù)已經(jīng)用于生物芯片、生物傳感器、生物反應(yīng)器、臨床診斷、藥物設(shè)計(jì)以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究。

2.2 多酶共固

為了充分發(fā)揮不同酶的各自優(yōu)勢(shì)，可以將酶—酶、酶—細(xì)胞、細(xì)胞—細(xì)胞共同固定化于同一載體上。Atia［6］用聚乙烯亞胺的氨基覆蓋多孔乙醛酸瓊脂表面的醛基做成惰性載體，并以此為載體進(jìn)行環(huán)己酮單加氧酶和葡萄糖－6－磷酸脫氫酶共價(jià)共固。許松偉等［7］將甲酸脫氫酶、甲醛脫氫酶和醇脫氫酶3種脫氫酶固定于新型ALG－SiO2雜化凝膠上，以原型煙酰胺腺嘌呤二核甙酸作為電子供體，通過三步連串反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了CO2到甲醇的轉(zhuǎn)化。多酶共固技術(shù)是酶、細(xì)胞固定化技術(shù)發(fā)展的綜合產(chǎn)物，它可以充分發(fā)揮不同酶的特點(diǎn)，將其催化特性結(jié)合起來，充分利用協(xié)同作用，提高其催化效率。

2.3 新型載體

隨著科學(xué)技術(shù)的日新月異，固定化酶對(duì)載體材料的要求也越來越高。理想的載體要具備良好的機(jī)械強(qiáng)度、較高的穩(wěn)定性和結(jié)合能力。在改進(jìn)傳統(tǒng)載體材料的同時(shí)，研究開發(fā)新型材料成為今后固定化酶載體研究的主要方向。Kato等［8］用N－異丙基丙烯酰胺和丙烯酰胺共聚合成的溫敏性凝膠載體具有低臨界溶解溫度特性，提高了固定化淀粉葡萄糖苷酶的催化能力。如今，導(dǎo)電載體作為固定化酶的一類新載體，在基于酶電極的生物傳感器領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。導(dǎo)電載體材料主要分為導(dǎo)電高聚物載體和導(dǎo)電復(fù)合載體兩大類，前者一般是具有共軛結(jié)構(gòu)和導(dǎo)電能力的有機(jī)聚合物，如聚苯胺、聚噻吩、聚吡咯及其衍生物［9－10］，后者是在導(dǎo)電材料中復(fù)合一些特殊物質(zhì)制得的導(dǎo)電復(fù)合載體［11］。隨著對(duì)固定化酶研究的不斷深入，設(shè)計(jì)、制備性能優(yōu)良的載體，將是固定化酶載體材料的發(fā)展方向。固定化酶技術(shù)必將隨著其載體材料技術(shù)的進(jìn)步而在各個(gè)領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

2.4 其它新技術(shù)

另外，還可以通過磁場(chǎng)、等離子體、納米技術(shù)、超聲波等新技術(shù)得到高性能的固定化酶。利用γ－射線可以引發(fā)丙烯醛與聚乙烯膜接枝聚合，活性醛基可共價(jià)固定化葡萄糖氧化酶［12］。劉薇等［13］采用改進(jìn)的共沉淀法以FeCl3和FeSO4制備了Fe3O4磁性納米粒子(20nm)，分別用于固定酵母乙醇脫氫酶和脂肪酶，表現(xiàn)出良好的磁分離性和催化性。今后，如何充分利用新載體、新方法來進(jìn)一步提高固定化酶的活力、回收率、降低成本必定會(huì)成為固定化酶研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

3 展望

目前，酶固定化技術(shù)已成為酶工程領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一，并已在多個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。研究探索新載體、新方法，來提高固定化酶的活性回收率、降低成本將成為固定化酶研究領(lǐng)域的主要方向，固定化酶必將在今后的工業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域發(fā)揮不可替代的作用。

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Research Progress of Enzyme Immobilization Techniques

QIN Sheng－li，YU Jian－sheng(College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao 266042，China)

TQ426.97

A

1003－3467(2011)05－0024－02

2011－01－19

秦勝利(1979－)，在讀碩士，E－mail:qsl0212@163.com;聯(lián)系人:于建生(1965－)，男，副教授，從事生物化工方面的研究工作。