種玉婷，李文哲，鄭國(guó)香,李成毅，劉 爽

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱 150030）

隨著石油等化石燃料的枯竭，尋找可代替化石燃料的新能源成為世界各國(guó)科學(xué)家的首要任務(wù)。纖維素因其是地球上產(chǎn)量最大且經(jīng)濟(jì)環(huán)保的可再生能源物質(zhì)，對(duì)于緩解未來(lái)的能源危機(jī)有著重要意義[1－3]。

近年來(lái)，隨著纖維素生物降解機(jī)理研究的不斷深入，如何發(fā)揮降解過(guò)程中微生物之間的協(xié)同與微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性作用成為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)降解的研究熱點(diǎn)[4－5]。因而充分利用自然界微生物間的協(xié)同關(guān)系，直接從自然環(huán)境中篩選能夠降解木質(zhì)纖維素的復(fù)合菌系成為一個(gè)新的研究趨勢(shì)[6]。王偉東等以高溫期的堆肥樣品為材料，篩選構(gòu)建了一組木質(zhì)纖維素分解菌復(fù)合系，該復(fù)合系在50℃培養(yǎng)條件3 d就可使濾紙崩潰率達(dá)到90%以上[7－8]。崔詩(shī)法等從腐爛的枯枝落葉中分離到一組分解能力較強(qiáng)的纖維素分解復(fù)合系St－13[9]，該復(fù)合系5 d內(nèi)可使濾紙完全崩潰，液體培養(yǎng)到14 d時(shí)能夠分解玉米秸稈中85.27%的纖維素，總失重率為58.03%。這些都為加速?gòu)?fù)合系的研究以及天然纖維素資源的利用開(kāi)辟了新的道路。

本研究以較難降解的稻稈為碳源，并控制培養(yǎng)溫度為35℃的中溫條件，篩選出一組稻稈降解率較高的復(fù)合系，命名為L(zhǎng)ZF－12。并探索了其生長(zhǎng)特性和生長(zhǎng)條件，為該菌系的進(jìn)一步優(yōu)化提供了重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣來(lái)源

分別從森林、沼澤邊等多處不同地點(diǎn)采取土樣24份，分別命名為樣品1－24號(hào)，進(jìn)行篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基

稻稈的預(yù)處理：先將稻稈浸泡在1%NaOH溶液中24 h，再用清水反復(fù)沖洗干凈，于50℃烘箱烘干后將其剪成長(zhǎng)度約為1 cm左右。

分離培養(yǎng)基：NaCl 0.5%，酵母粉0.1%，蛋白胨0.5%，CaCO30.3%，經(jīng)處理的稻稈1%，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 纖維素分解菌群生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

用250 mL的錐形瓶裝入200 mL分離培養(yǎng)基,接入20 mL種子液,35℃靜置培養(yǎng)，每隔12 h取樣，用752型分光光度計(jì)測(cè)定600 nm時(shí)的吸光度，以未接菌的培養(yǎng)基作對(duì)照。

1.2.2 稻稈失重的測(cè)定

將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液用八層紗布過(guò)濾，然后用鹽酸和硝酸的混合液沖洗紗布中剩余物，以除去殘留的菌體和碳酸鈣，再用清水反復(fù)沖洗多次，最后置于烘箱中烘至恒重[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌系LZF-12的篩選

初次篩選時(shí)，取24份土樣分別接種于分離培養(yǎng)基中，定期跟蹤觀察濾紙變化，以濾紙崩解程度作為初期篩選的指標(biāo)。在濾紙降解的旺盛時(shí)期以10%的接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中，如此反復(fù)轉(zhuǎn)接下去。以濾紙完全被降解掉所用的時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)衡量菌系的降解能力，多數(shù)樣品在傳代過(guò)程中因其對(duì)濾紙分解能力弱而被淘汰，而10和12號(hào)樣品因其良好的濾紙降解能力和穩(wěn)定的菌群特性被連續(xù)轉(zhuǎn)接下去，以稻稈作為主要碳源定向馴化后，經(jīng)過(guò)三十多次的傳代培養(yǎng)，最后獲得一組降解效果較好且穩(wěn)定的菌系，命名為L(zhǎng)ZF－12。

2.2 復(fù)合菌系LZF-12的形態(tài)觀察

通過(guò)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對(duì)復(fù)合菌系的生長(zhǎng)形態(tài)進(jìn)行了觀察。在低倍的光學(xué)顯微鏡下對(duì)培養(yǎng)7 d的菌液進(jìn)行觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖1－A）復(fù)合系LZF－12主要由桿菌組成，且菌體密集。這表明此時(shí)菌群代謝旺盛，消耗底物的速率也相對(duì)較快。由于不同的復(fù)合菌系自身菌群的多樣性不同，往往表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征。如劉震東等[10]獲得的高溫降解纖維素復(fù)合菌系主要是由長(zhǎng)桿菌構(gòu)成。而培養(yǎng)發(fā)酵中期的樣本在電子顯微鏡的放大結(jié)果顯示，LZF－12的菌群組成比較復(fù)雜，從外觀形態(tài)來(lái)看，粗細(xì)、長(zhǎng)短不一，從數(shù)量上看桿菌占優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，桿菌之間夾雜著少量的球狀菌、梭狀菌和啞鈴狀菌等，如圖1－B標(biāo)注。這表明，LZF－12中的菌群多樣，菌系彼此共生在同一個(gè)環(huán)境中。

圖1 LZF-12發(fā)酵中期的形態(tài)特征Fig.1 Conformation character of LZF-12 in mediumterm fermentation

2.3 復(fù)合菌系LZF-12的生長(zhǎng)特性

2.3.1 LZF－12的生長(zhǎng)曲線

以稻稈為主要碳源培養(yǎng)復(fù)合菌系LZF－12，600 nm下測(cè)定的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。微生物經(jīng)過(guò)1～5 d的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后達(dá)到最高值，OD600值為3.107，之后又開(kāi)始下降，從7 d開(kāi)始OD600呈現(xiàn)平穩(wěn)狀況，其值變化很小。由圖2可知，復(fù)合系從初始到峰值大致可分為三個(gè)增殖階段，其增殖速率依次下降。在接種后的前24 h復(fù)合系呈快速生長(zhǎng)狀態(tài)，24 h后其增長(zhǎng)速度明顯下降，而由后面試驗(yàn)可知，培養(yǎng)基的溶解氧也是在24 h內(nèi)快速下降到最低值的，由此可推斷復(fù)合系的總體活性很有可能跟培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧有關(guān)系，當(dāng)復(fù)合系中的好氧菌將培養(yǎng)基中95%以上的氧消耗盡時(shí)，所形成的微好氧環(huán)境必定會(huì)抑制好氧菌的生長(zhǎng)，致使復(fù)合系的總體增殖速度下降。從圖2中曲線我們可以看出在72 h左右又出現(xiàn)一轉(zhuǎn)折點(diǎn)，從72到120 h左右為復(fù)合系增殖的最后階段，由曲線傾斜度可知該階段微生物數(shù)量增加緩慢，而這一時(shí)間段與試驗(yàn)中復(fù)合系對(duì)濾紙的快速降解階段相吻合，可能是該時(shí)間段復(fù)合系開(kāi)始利用培養(yǎng)基中較難利用的纖維素類物質(zhì)所致。隨著結(jié)構(gòu)復(fù)雜的纖維素類物質(zhì)被降解成易利用的低糖類成分，發(fā)酵液內(nèi)微生物的數(shù)量反而下降，這可能是由于復(fù)合菌系在消耗碳源的同時(shí)，產(chǎn)生了大量的揮發(fā)酸等產(chǎn)物，隨著這些產(chǎn)物的積累，反饋抑制了微生物體內(nèi)相應(yīng)酶的活性，從而影響微生物菌群的生長(zhǎng)。該階段，復(fù)合系對(duì)稻稈的分解與對(duì)培養(yǎng)基中各種酸類物質(zhì)的降解達(dá)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，故其生長(zhǎng)曲線顯示出較平穩(wěn)的狀態(tài)。

圖2 復(fù)合菌系LZF-12的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of complex system LZF-12

2.3.2 發(fā)酵液的DO值變化

以10%的接種量將復(fù)合系接種于分離培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)。每24 h測(cè)其DO值（見(jiàn)圖3）。新鮮分離培養(yǎng)基DO值為2.3 mg·L-1左右，含氧量較為豐富。由圖3可以看出在接菌后的二十幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，DO值由初始的2.3 mg·L-1急劇下降到0.07 mg·L-1，之后瓶?jī)?nèi)DO值基本都維持在0.07～0.09 mg·L-1之間，在192 h之后又開(kāi)始緩慢下降，到發(fā)酵結(jié)束后其DO值為0.05 mg·L-1左右。在發(fā)酵的初期，溶氧的急劇下降說(shuō)明該菌系有好氧性菌株存在，當(dāng)DO值降至0.07 mg·L-1的微好氧環(huán)境時(shí)，體系內(nèi)的好氧菌的生長(zhǎng)受到抑制。在此后的培養(yǎng)中，培養(yǎng)基一直處于微好氧環(huán)境，而且試驗(yàn)復(fù)合系對(duì)濾紙的快速降解過(guò)程也是在這樣的環(huán)境中完成的，這說(shuō)明微好氧的環(huán)境更適合該菌系對(duì)木質(zhì)纖維素物質(zhì)的降解，而復(fù)合系中的好氧菌在前期快速消耗體系內(nèi)的溶解氧，為微好氧菌的增殖和降解提供了有利的環(huán)境。二者的有機(jī)配合共同促進(jìn)了復(fù)合系對(duì)木質(zhì)纖維類物質(zhì)的降解。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中的DO值的變化Fig.3 Change of DO value in fermentation

2.3.3 不同初始pH對(duì)發(fā)酵體系內(nèi)pH變化的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH調(diào)到4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，接種量為10%，35℃條件靜置培養(yǎng)，每24 h監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系內(nèi)的pH值。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同初始pH下發(fā)酵液的pH變化Fig.4 Changes of ferment liquid pH with different initial pH

由圖4可見(jiàn)，不同初始pH的各試驗(yàn)組，接種后其發(fā)酵液內(nèi)的pH均有向中性靠攏的趨勢(shì)，pH為4～5的發(fā)酵液在24 h時(shí)回升到6左右，其余的發(fā)酵液均在24 h時(shí)維持在7左右，在之后的48 h內(nèi)各發(fā)酵液的pH基本沒(méi)有變化，從100 h左右起，各發(fā)酵液的pH呈緩慢上升趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，復(fù)合系表現(xiàn)了很強(qiáng)的pH調(diào)節(jié)能力，總的規(guī)律是先將pH調(diào)到中性或微酸性，在此階段，復(fù)合系先利用培養(yǎng)基中容易消化的糖類物質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)變成有機(jī)酸，從而導(dǎo)致pH的下降。隨著產(chǎn)生的有機(jī)酸被分解或轉(zhuǎn)化后，pH又開(kāi)始緩慢回升，這與復(fù)合系對(duì)底物的利用相吻合。

2.4 復(fù)合菌系LZF-12的降解特性觀察

2.4.1 LZF-12的濾紙降解特性

復(fù)合菌系LZF-12降解濾紙的表觀現(xiàn)象表明，在濾紙崩潰的整個(gè)過(guò)程中，前期降解速度較慢，如圖5-a～b所示，接菌后的前3 d濾紙變化不明顯，84 h左右時(shí)開(kāi)始觀察到濾紙變軟變薄，而在之后的培養(yǎng)中濾紙降解明顯加快?？梢郧宄目吹綇囊好嫦? cm處至底端的濾紙降解非常明顯，到100 h左右時(shí)濾紙從液面下1 cm處斷裂浸入到培養(yǎng)基中，在120 h左右時(shí)斷裂的濾紙完全被降解掉。復(fù)合菌系LZF-12內(nèi)的菌群在前期生長(zhǎng)過(guò)程中，先利用培養(yǎng)基中較易利用的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行快速繁殖，到84 h以后菌群利用濾紙現(xiàn)象逐漸明顯，自身菌群繁殖速度達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，直至120 h左右濾紙完全被消耗。

圖5 復(fù)合菌系LZF-12降解濾紙的過(guò)程Fig.5 Course of filter paper degradation by complex system LZF-12

2.4.2 LZF-12的稻稈降解特性

本組試驗(yàn)是選用數(shù)根稻稈莖，用細(xì)繩將其捆綁一起置于培養(yǎng)基中。圖6-A和B分別是稻草葉面經(jīng)復(fù)合菌系作用前后的掃描電子顯微照片，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，對(duì)照（A圖）的細(xì)胞排列整齊、規(guī)則平整，而B(niǎo)中經(jīng)菌作用后的葉片表面的表皮細(xì)胞、硅化/木栓細(xì)胞列等已經(jīng)被破壞和撕裂開(kāi)，結(jié)構(gòu)破壞明顯，細(xì)胞表面的蠟質(zhì)層也被破壞掉，有利于細(xì)菌的侵入。由圖6-C可知，在復(fù)合系LZF-12的作用下，稻莖中起粘連和支撐作用的薄壁組織在復(fù)合系的作用下被降解掉，導(dǎo)致7天左右稻稈便軟化浸入培養(yǎng)基中。圖6-D顯示，復(fù)合菌系已經(jīng)完全侵入稻草的內(nèi)部結(jié)構(gòu)組織，破壞維管組織周圍的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使包裹其中的大維管束裸露并呈現(xiàn)出來(lái)，同時(shí)可以清晰的看到菌群已經(jīng)大量的在維管組織及其他組織細(xì)胞之間生存集聚，從而加劇對(duì)底物稻草的破壞程度和速度，見(jiàn)圖6-D所標(biāo)示。

2.4.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)復(fù)合系降解效果的影響

將復(fù)合菌系分別置于靜置和搖床條件下培養(yǎng)，溫度均為35℃，搖床轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。280 h后測(cè)稻稈的失重。從圖7可以看出，從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程來(lái)看，兩條曲線的變化趨勢(shì)比較相似，在接種后的前70 h內(nèi)降解速率比較快，可能是復(fù)合系先利用稻稈中的糖類、果膠類物質(zhì)，待將包裹其中的半纖維素、纖維素類物質(zhì)釋放出來(lái)，開(kāi)始誘導(dǎo)相關(guān)的酶系從而對(duì)其降解，由于纖維素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，所以降解速度也相對(duì)慢些。整個(gè)過(guò)程中，搖床條件下的稻稈失重率始終高于靜置條件下的，但最終的降解率又非常接近，分別為64.94%和62.84%，這與前文所說(shuō)的微好氧環(huán)境更適合復(fù)合系對(duì)纖維素物質(zhì)的降解似乎有矛盾，其實(shí)不然，由于瓶口密封較好，且搖床轉(zhuǎn)速也較低，所以瓶中溶氧并沒(méi)有太大提高，倒是搖床條件下瓶中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混合均勻，更有利于復(fù)合系的吸收利用?？紤]到搖床條件下在后期的發(fā)酵中會(huì)消耗較大能量，選擇在靜置條件下對(duì)復(fù)合系進(jìn)行馴化培養(yǎng)。

圖6 復(fù)合菌系LZF-12降解稻草的表觀特征Fig.6 Apparent character of straw degredating by LZF-12

圖7 不同培養(yǎng)條件下復(fù)合系對(duì)稻稈的降解能力Fig.7 Capacity of degradation under different culture condition

3 討論

稻稈是一種較難被降解利用的天然纖維素類物質(zhì)，經(jīng)堿處理的稻稈其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素總含量占70%左右，纖維類含量較高。纖維素的降解是在幾種不同的酶的協(xié)同作用下完成的，參與降解的酶系屬于誘導(dǎo)型，因此復(fù)合系先利用培養(yǎng)基中容易利用的碳源進(jìn)行增殖，待將其消耗殆盡時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)降解纖維素的酶系，否則較高的易利用碳源濃度會(huì)抑制纖維素酶的合成[11-13]。復(fù)合系LZF-12對(duì)濾紙的降解過(guò)程也體現(xiàn)了這一點(diǎn)，即復(fù)合系LZF-12先利用培養(yǎng)基中容易利用的碳源進(jìn)行增殖，大約在接種后前70 h左右，這時(shí)瓶中濾紙基本無(wú)變化，當(dāng)復(fù)合系達(dá)到一定數(shù)量、易利用的碳源被消耗掉時(shí)，開(kāi)始誘導(dǎo)復(fù)合系產(chǎn)生降解纖維素類物質(zhì)的相關(guān)酶系，從而對(duì)濾紙進(jìn)行降解。

在復(fù)合系LZF-12的作用下，7 d左右稻稈被破壞明顯，起支撐和粘連作用的薄壁組織基本被降解掉，暴露出更難降解的維管束類結(jié)構(gòu)，通過(guò)觀察復(fù)合系對(duì)濾紙和稻稈的降解可知，起降解作用的主要是其中的微好氧菌，這對(duì)于復(fù)合系培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化提供了重要參考價(jià)值。本研究只對(duì)稻稈的表觀變化進(jìn)行觀察，對(duì)于其降解率及發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)物分析還有待于進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

a.通過(guò)以稻稈為碳源并在中溫35℃培養(yǎng)的定向馴化，從24組原始土樣中成功篩選出一組稻稈降解率較高且相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合菌系，命名為L(zhǎng)ZF-12。該復(fù)合菌系6 d內(nèi)即可將濾紙完全降解，7 d即可軟化稻稈。

b.LZF-12復(fù)合系由好氧菌株和微好氧菌株構(gòu)成，好氧菌通過(guò)消耗培養(yǎng)基溶解氧為微好氧菌營(yíng)造適宜環(huán)境，而木質(zhì)纖維物質(zhì)的降解主要依靠微好氧菌。與靜置條件相比，低轉(zhuǎn)速搖床下培養(yǎng)基中物質(zhì)混合均勻，稻稈降解率也較高。

c.不同初始pH條件下，復(fù)合菌系發(fā)酵過(guò)程的環(huán)境pH變化趨勢(shì)基本一致，表明該菌系對(duì)環(huán)境pH的變化具有較強(qiáng)的緩沖調(diào)節(jié)能力。

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