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        白色鏈霉菌分批發(fā)酵ε-聚賴氨酸的動力學(xué)分析

        2011-04-09 08:41:30李文杰賈士儒范寶慶王國良鄭竹琳
        化學(xué)工業(yè)與工程 2011年6期
        關(guān)鍵詞:生長模型

        鐘 成,李文杰,賈士儒* ,范寶慶,王國良,鄭竹琳

        (1.教育部工業(yè)微生物重點實驗室(天津科技大學(xué)),天津300457;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津300457)

        ε-聚-L-賴氨酸(ε-poly-L-lysine,簡寫 ε-PL)是由25~35個單體 L-賴氨酸通過 α-羧基和 ε-氨基通過酰胺鍵依次連接而成的陽離子型的天然氨基酸聚合物。最早由 Shima和 Sakai在篩選與Dragendorff試劑呈陽性反應(yīng)的物質(zhì)時偶然發(fā)現(xiàn),是由白色鏈霉菌346分泌的一種胞外物質(zhì)[1-2]。在酸性和微酸性環(huán)境中 ε-聚賴氨酸對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抑制作用,而且其水溶性好、熱穩(wěn)定性高、可降解、可食用,對人體和環(huán)境無毒。因此它和它的衍生物由于其廣泛的工業(yè)應(yīng)用(如食品,醫(yī)藥,環(huán)境和電子技術(shù)),在過去幾年里已引起了人們廣泛的興趣。ε-PL和它的衍生物有多種不同的應(yīng)用,如作為食品防腐劑、乳化劑、食療劑、可降解纖維、可高度吸水的凝膠、藥物載體、抗癌劑增強因子和生物芯片。1989年日本批準(zhǔn)其用于食品加工中,此后,韓國和美國也陸續(xù)批準(zhǔn)其作用食品添加劑[3]。

        自發(fā)現(xiàn)白色鏈霉菌Lysinopolymerus strain 346以來,人們針對ε-PL生產(chǎn)菌株的發(fā)酵過程與發(fā)酵條件進行了大量的優(yōu)化,以提高ε-PL的最終產(chǎn)量。如Shima等[1,4]采用了 2 步培養(yǎng)的方法,先將菌體 S.albulus接種于20 g/L甘油,5 g/L酵母浸膏的種子培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h,溫度30℃;然后通過過濾收集菌體,將富集菌體移入含20 g/L葡萄糖、20 g/L檸檬酸和10 g/L(NH4)2SO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過2步培養(yǎng)的方法,8~9 d后ε-PL的發(fā)酵產(chǎn)量可達4~5 g/L。Kahar等[5]通過 pH值的調(diào)控來調(diào)節(jié)菌體的生長和 ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量,采用菌株 S.albulus 410在5 L機械攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵,培養(yǎng)基為M3G,通過半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),在消耗大量能量的前提下采用pH值來控制。試驗過程分為2個階段,在前期菌體生長階段控制發(fā)酵液的pH值大于5.0,在后期ε-聚賴氨酸合成階段發(fā)酵液 pH值控制在4.0左右。通過這一半連續(xù)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),ε-PL產(chǎn)量由原先5.2 g/L上升到48.3 g/L。

        在微生物發(fā)酵過程的研究中,實現(xiàn)發(fā)酵過程優(yōu)化與控制是發(fā)酵過程的重要目標(biāo)和研究熱點。通過菌株選育得到高產(chǎn)菌株,并通過發(fā)酵過程的優(yōu)化控制,可以最大限度地發(fā)揮菌株的生產(chǎn)潛力。本研究考察了白色鏈霉菌分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸過程的生長動力學(xué),并建立了菌株生長動力學(xué)模型,對模型的動力學(xué)參數(shù)進行了求解,為發(fā)酵過程的優(yōu)化與控制提供了理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 菌種與培養(yǎng)方法

        白色鏈霉菌UV80(Streptomyces UV80)由天津科技大學(xué)生化工程研究室保藏[6]。斜面培養(yǎng):取4℃冰箱中保存的菌種,接種至斜面培養(yǎng)基中,30℃恒溫培養(yǎng)5~7 d至長滿灰色孢子。一級搖瓶種子培養(yǎng):取一環(huán)斜面菌體接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,30℃,220 r/min,旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)一定的時間。二級搖瓶種子培養(yǎng):以體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量將一級種子培養(yǎng)液接入裝有90 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,30℃,220 r/min,旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)一定的時間。發(fā)酵罐培養(yǎng):貝朗5 L發(fā)酵罐。初始pH值為6.8,初始糖質(zhì)量濃度50 g/L,溫度30℃,通風(fēng)量1~2 vvm(vvm即通氣比,每分鐘通氣量與罐體實際料液體積的比值),控制DO 30%(攪拌轉(zhuǎn)速為300~1 000 r/min)。

        1.2 分析方法

        菌體干重采用烘干法測量。濾紙預(yù)先于烘箱95℃烘至恒重,取10 mL發(fā)酵液,在4 000 r/min條件下離心8 min,沉淀用無菌水洗滌2~3次,濾紙過濾,將濾紙和菌體在烘箱中95℃干燥至恒重,計算菌體干重。殘?zhí)欠治霾捎萌?0 mL發(fā)酵液,4 000 r/min,離心 8 min,取上清液,使用 SBA-40C生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院微生物研究所)測定發(fā)酵液中的葡萄糖濃度。

        發(fā)酵液經(jīng)初步預(yù)處理、離心分離、D392大孔徑弱堿性陰離子交換樹脂、D152大孔徑弱酸性陽離子交換樹脂以及乙醇沉淀和噴霧干燥,得到ε-聚賴氨酸。ε-聚賴氨酸的含量采用高效液相色譜法測量[7]。其色譜條件為:色譜柱為 TSKgel ODS-120T,φ4.6 mm×25 cm。采用紫外分光檢測器,檢測波長為215 nm。柱溫40℃。將磷酸氫二鉀1.70 g和硫酸鈉1.42 g溶于800 mL水中,用磷酸調(diào) pH值至3.4后用水定容至1 000 mL,之后取此溶液920 mL加入80 mL乙腈作為流動相。采用 L-苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo),進樣量為 20 μL。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 白色鏈霉菌分批發(fā)酵生產(chǎn) ε-聚賴氨酸的生長動力學(xué)分析

        圖1~圖3為5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn) ε-聚賴氨酸過程的底物消耗、菌體生長以及產(chǎn)物生成的變化曲線。圖 1~圖 3中,矩形為實測值,實線為Sigmoid模型擬合的曲線。

        圖1 底物濃度隨時間的變化情況Fig.1 Changes of substrate concentration over time

        由圖1可以看出,菌體在8~32 h耗糖速度迅速加快,之后耗糖速度緩慢下降,發(fā)酵結(jié)束時,發(fā)酵液殘留葡萄糖濃度為38 g/L。圖2表明菌體在8~24 h內(nèi)長較快,于32 h時到最大值,此時細(xì)胞干重(DCW)為5.75 g/L,隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行,菌體量緩慢下降。由圖3可見,當(dāng)白色鏈霉菌生長到一定階段,ε-聚賴氨酸才開始在發(fā)酵液中積累,可能是細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成存在部分偶聯(lián)關(guān)系,ε-聚賴氨酸在8~48 h大量合成并于48 h達到最大值,即0.9 g/L。

        圖2 菌體量隨時間的變化情況Fig.2 Changes of biomass growth over time

        圖3 ε-聚賴氨酸隨時間的變化的情況Fig.3 Changes of ε-pL production over time

        2.2 ε-聚賴氨酸分批發(fā)酵生產(chǎn) ε-聚賴氨酸的Sigmoid模型

        由于微生物本身代謝生長的復(fù)雜性,要建立它們的結(jié)構(gòu)生長模型非常的復(fù)雜。因此實際過程當(dāng)中,經(jīng)常用到經(jīng)驗和半經(jīng)驗但沒有明確生物學(xué)意義的數(shù)學(xué)方程來描繪其生長規(guī)律,其中常用的方程如Monod以及 Logistic模型等[8]。Sigmoid模型在工程領(lǐng)域中常用來擬合“S”形曲線,其對應(yīng)的函數(shù)(Boltzmann函數(shù))如方程(1)所示。

        運用Sigmoid模型對ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程的生物量、殘?zhí)恰a(chǎn)物濃度進行擬合,如圖1,圖2和圖3中實線所示。

        由圖1可知,模型預(yù)測值(實線)基本上能夠較好地吻合試驗所測值(矩形),表明 Sigmoid模型在白色鏈霉菌生長規(guī)律方面有較好的適應(yīng)性。生物量、殘?zhí)?、ε-聚賴氨酸?jīng) Sigmoid模型擬合后的數(shù)學(xué)方程見式(2)~式(4)。

        Sigmoid模型擬合菌體生長動力學(xué)方程為

        Sigmoid模型擬合產(chǎn)物形成動力學(xué)方程為

        Sigmoid模型擬合底物消耗動力學(xué)方程為

        2.3 動力學(xué)參數(shù)求解

        細(xì)胞比生長速率(μ)、葡萄糖比消耗速率(qs)和ε-聚賴氨酸比合成速率(qε-pl)定義式分別為:

        當(dāng)時間間隔很小時,可以近似用式(6)直接計算得到 μ,qs,qε-pl。

        利用Origin繪圖軟件對試驗數(shù)據(jù)進行插值計算(時間間隔0.1 h),再用Excel軟件求解得到發(fā)酵不同時刻的 μ、qs和 qε-pl,經(jīng) Origin 軟件繪圖后平滑處理得到不同時刻白色鏈霉菌生產(chǎn) ε-聚賴氨酸過程動力學(xué)參數(shù)變化曲線[9-10],見圖 4。

        圖4表明細(xì)胞比生長速率在5.8 h達到最大值,為0.263 55 h-1;葡萄糖比消耗速率在12 h達到一個最大值,為0.004 326 h-1,之后到 30 h以后,它的值隨著時間的延長,不斷地增加;此時可以看出底物的消耗主要用于ε-聚賴氨酸的合成,ε-聚賴氨酸比合成速率在 36 h達到最大值,為0.008 88 h-1。另外,由圖4可知,ε-聚賴氨酸的合成與細(xì)胞的生長呈現(xiàn)復(fù)雜的部分偶聯(lián)關(guān)系,符合 Luedeking-Piret方程,通過回歸分析可得ε-聚賴氨酸的合成與細(xì)胞生長的偶聯(lián)系數(shù)關(guān)系式。

        圖4 ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程細(xì)胞比生長速率(μ)、葡萄糖比消耗速率(qs)、ε-PL的比合成速率(qε-pL)隨時間的變化曲線Fig.4 Changes of specific growth rate(μ),specific glucose consumption rate(qs),specific ε-pL production rate(qε|pL)over time during ε-pL fermentation process

        2.4 ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程中得率的變化

        相應(yīng)的,根據(jù)式(8)可計算得到發(fā)酵過程中細(xì)胞對葡萄糖的得率(Yx/s),ε-聚賴氨酸對葡萄糖的得率 Yε-pl/s隨時間的變化曲線。

        圖5 ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程中細(xì)胞對葡萄糖的得率(Yx/s)、ε-聚賴氨酸對葡萄糖的得率 Yε-pl/s隨時間的變化曲線Fig.5 Changes of Yx/s,Yε-pL/sover time during ε-pL fermentation process

        對底物的得率系數(shù)表征菌體攝取底物用于自身生長或代謝產(chǎn)物合成的能力[11]。圖5中菌體對葡萄糖的得率系數(shù)隨發(fā)酵時間的延長先升高后逐漸降低,表明前期細(xì)胞代謝底物主要用于菌體自身的生長,而ε-聚賴氨酸的得率系數(shù)隨著時間的延長逐漸的升高,在發(fā)酵停止時仍有升高的趨向,即為0.5 g/g,表明在發(fā)酵后期菌體利用葡萄糖合成 ε-聚賴氨酸的能力在增強,并且逐漸增加。

        3 結(jié)論

        通過對ε-聚賴氨酸分批發(fā)酵過程進行分析,運用Sigmoid模型擬合得出底物消耗、菌體生長和產(chǎn)物形成的動力學(xué)方程,并對發(fā)酵過程當(dāng)中的一些參數(shù)進行了動力學(xué)分析,模擬結(jié)果與試驗數(shù)據(jù)具有很好的相關(guān)性,研究為ε-聚賴氨酸生產(chǎn)的分批發(fā)酵法和補料分批發(fā)酵法提供了重要的理論依據(jù)。

        參考文獻:

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