李連印，姜君儀，劉俊江，李守賓，高雙友

0 引言

膀胱鏡和尿細(xì)胞學(xué)檢查是診斷膀胱移行細(xì)胞癌應(yīng)用較廣泛的方法。膀胱鏡檢查是一種侵入性檢查，且費(fèi)用昂貴;而尿細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)膀胱癌檢測(cè)靈敏度相對(duì)較差［1］。理想的監(jiān)測(cè)膀胱癌復(fù)發(fā)的手段不僅應(yīng)具有較高的靈敏性和特異性，且應(yīng)該具有無(wú)創(chuàng)性。近年來(lái)，有學(xué)者已提出通過(guò)檢測(cè)尿液來(lái)診斷膀胱癌，例如膀胱腫瘤抗原測(cè)試、細(xì)胞核基質(zhì)蛋白22、膀胱癌特異性核基質(zhì)蛋白4，尿端粒酶等［2-3］。雖然大部分已被證明比細(xì)胞學(xué)檢測(cè)敏感性高，但特異性仍然較低。熒光標(biāo)記DNA探針的方法一定程度地解決了這個(gè)問(wèn)題［4-5］。文中前瞻性地檢測(cè)后續(xù)治療的膀胱癌患者熒光原位雜交DNA探針(UroVysion原位雜交法)的敏感性和特異性，并將結(jié)果與尿細(xì)胞學(xué)比較，以評(píng)估其在膀胱癌復(fù)發(fā)檢測(cè)中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象2008年4月至2010年10月間，我科共收集接受經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切后膀胱尿路上皮癌患者58例，膀胱鏡檢查留取尿液樣本，部分被送往病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查，另一部分行細(xì)胞遺傳學(xué)熒光原位雜交分析。膀胱鏡、細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和熒光原位雜交分析均獨(dú)立完成。如發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞或高度可疑的細(xì)胞，細(xì)胞學(xué)檢測(cè)定義為陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。膀胱鏡檢查中發(fā)現(xiàn)有疑似病灶或腫瘤的患者將被安排做活檢或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)，并記錄膀胱鏡下發(fā)現(xiàn)的腫瘤大小、位置和數(shù)目，并根據(jù)世界衛(wèi)生組織分級(jí)制度，同時(shí)依照膀胱癌臨床分期慣例進(jìn)行分期。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 熒光原位雜交法將20～50ml新鮮尿液以2∶1比例與2%聚乙二醇混合，存放在4℃環(huán)境24 h內(nèi)處理。脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)速500 r/min離心10 min，離心半徑為7 cm，用甲醇冰醋酸復(fù)合溶液按體積比3∶1固定后再次離心沉淀，將沉淀的細(xì)胞用10 μl固定液懸浮，制成切片。熒光原位雜交采用UroVysion膀胱癌DNA探針檢測(cè)試劑盒(美國(guó)雅培公司)，探針包括3個(gè)重復(fù)序列，以識(shí)別3號(hào)、7號(hào)和17號(hào)染色體的著絲粒部位。另外還有一特殊位點(diǎn)序列，可與9p21雜交。這些DNA序列分別由SpectrumRed，SpectrumGreen，SpectrumAqua和SpectrumGold熒光標(biāo)記［5-6］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，將切片在檸檬酸鈉緩沖液溶液中73℃孵育2 min后，用含0.008%胃蛋白酶的0.01 mol/L的鹽酸溶液，37℃消化10 min。在PBS水洗后，用1%甲醛在室溫下固定，并脫水。UroVysion的溶劑滴加在載玻片上的特定區(qū)域，并將其蓋住。Codenaturation 80℃干燥烘箱烘干8 min后，可獲得變性探針和染色體DNA，在潮濕的環(huán)境下37℃放置20h，可完成雜交。雜交后用檸檬酸鈉緩沖液與0.3%乙基苯基聚乙二醇混合液73℃下沖洗2 min，隨后滴加檸檬酸鈉緩沖液與0.3%乙基苯基聚乙二醇混合液，在室溫下放置1 min?？諝飧稍锖?，4′，6二月米基-2-苯基吲哚Ⅱ進(jìn)行反染色染色，并根據(jù)試劑盒進(jìn)行結(jié)果分析。雜交面積用×40物鏡檢視掃描細(xì)胞學(xué)上的非典型細(xì)胞核，例如細(xì)胞核增大、不規(guī)則輪廓，并呈片狀。不正常的細(xì)胞核指擁有2套DNA基因拷貝數(shù)，或者缺失9p21純合子的信號(hào)。不正常的標(biāo)本指超過(guò)16%細(xì)胞有多重染色體，或者48%細(xì)胞缺失9p21純合子的信號(hào)(圖1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理。采用多個(gè)樣本構(gòu)成比的比較。特異性計(jì)算方法=真陰性/(真陰性+假陽(yáng)性);敏感性計(jì)算方法=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性)。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陽(yáng)性);陰性預(yù)測(cè)值=真陰性/(真陰性+假陰性)。以P≤0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 尿路正常上皮細(xì)胞和尿路上皮癌細(xì)胞的UroVysion熒光原位雜交法檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Results of UroVysion FISH for bladder cancer and normal uroepithelium

2 結(jié)果

本次研究共納入研究對(duì)象58例，男女比例5.33∶1，平均年齡為68歲(67.5±8.4)歲，所有患者平均隨訪時(shí)間為(20.4±6.3)個(gè)月。41例患者確診為膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)。17例患者經(jīng)尿液細(xì)胞學(xué)檢查、UroVysion熒光原位雜交法檢查、膀胱鏡檢查均正常。其中，尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)18例為陽(yáng)性(敏感性為43.9%)，熒光原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)36例陽(yáng)性(敏感性為87.8%)，敏感度明顯高于脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果見表1。所有UroVysion熒光原位雜交法和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤患者均經(jīng)膀胱鏡檢查和病理診斷，證實(shí)膀胱癌復(fù)發(fā)，故熒光原位雜交和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的特異性均為100%。特別需要指出的是，1例膀胱憩室內(nèi)臨床分期為Ⅰ期但是病理分級(jí)為3級(jí)的腫瘤復(fù)發(fā)，但細(xì)胞學(xué)檢測(cè)或熒光原位雜交檢測(cè)均陰性。在UroVysion熒光原位雜交法檢測(cè)陽(yáng)性的病例中，17例為G3級(jí)腫瘤，12例為G2級(jí)腫瘤，7例為G1級(jí)腫瘤;相比之下，尿液細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15例為G3級(jí)腫瘤，3例為G2級(jí)腫瘤，無(wú)G1級(jí)腫瘤陽(yáng)性病例(表2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UroVysion熒光原位雜交法法比細(xì)胞學(xué)檢測(cè)更加有效。

表1 UroVysion熒光原位雜交法檢測(cè)與尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)膀胱癌復(fù)發(fā)結(jié)果(%)Table 1 Specificity and sensitivity of UroVysion FISH and urine cytology for the diagnosis of bladder cancer(%)

表2 UroVysion熒光原位雜交法檢測(cè)與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)膀胱癌復(fù)發(fā)結(jié)果(n)Table 2 UroVysion FISH and urine cytology for the diagnosis of bladder cancer of different grades(n)

3 討論

膀胱癌好發(fā)于中老年男性，具有較高的復(fù)發(fā)率，對(duì)復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)，能夠提高患者治療效果和延長(zhǎng)患者生存期。目前對(duì)膀胱癌術(shù)后的隨訪一般為每隔一段時(shí)間進(jìn)行膀胱鏡檢查及尿液中脫落細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)分析。膀胱鏡檢查是一種有創(chuàng)檢查方式，且費(fèi)用昂貴［2，7］。而尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查特異性約為96%至100%，但對(duì)G1、G2、G3腫瘤細(xì)胞的敏感性約20%、50%和80%。因此，尿液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)作為檢查方法并不可靠。近年來(lái)，微衛(wèi)星技術(shù)已被用來(lái)檢測(cè)基因組雜合性損失的和不穩(wěn)定病變。測(cè)試篩選膀胱癌患者敏感性為100%，特異性為96%［8-10］。然而，這種技術(shù)還需要大量的病例試驗(yàn)［11］。熒光原位雜交技術(shù)近年來(lái)的發(fā)明和應(yīng)用為膀胱癌的早期診斷提供了有效的途徑。熒光原位雜交技術(shù)基本原理是通過(guò)標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種基因狀態(tài)的信息。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交技術(shù)具有安全、快速、靈敏度高、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高以及能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)。

腫瘤生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)體腫瘤在其生長(zhǎng)的初期大量染色體復(fù)制過(guò)程中，產(chǎn)生隨機(jī)的基因獲得或缺失，這種現(xiàn)象被稱為染色體不穩(wěn)定現(xiàn)象。膀胱癌細(xì)胞中常發(fā)生染色體變化，比如常見的染色體拷貝數(shù)的變化、抑癌基因的缺失等，都可能在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用。最初，腫瘤細(xì)胞的染色體非整倍體研究由流式細(xì)胞儀檢測(cè)，但限制過(guò)多，難應(yīng)用于了臨床。近年來(lái)，熒光原位雜交法已被證明是有效檢測(cè)細(xì)胞間期的細(xì)胞染色體非整倍體的工具［12］。最新發(fā)展多色DNA探針大大提高檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中異常染色體對(duì)的能力。

研究中發(fā)現(xiàn)，UroVysion熒光原位雜交法檢測(cè)膀胱癌的敏感度明顯高于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的敏感度，這與其他一些國(guó)外學(xué)者的研究結(jié)果一致［13］。一些G1和G2級(jí)腫瘤尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查為陰性，但UroVysion熒光原位雜交法結(jié)果則發(fā)現(xiàn)了異常的染色體改變。一些國(guó)外學(xué)者還報(bào)道，UroVysion熒光原位雜交法對(duì)pTis檢測(cè)比細(xì)胞學(xué)檢測(cè)更有優(yōu)勢(shì)［14］。因此，UroVysion熒光原位雜交法檢查更適合腫瘤分級(jí)較低的患者。但我們的研究中有1例膀胱憩室內(nèi)癌復(fù)發(fā)患者，但細(xì)胞學(xué)和UroVysion熒光原位雜交法實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。該患者腫瘤分期G3pT1，因此推測(cè)腫瘤負(fù)荷低不是導(dǎo)致尿液中的異常細(xì)胞缺乏的原因，位于膀胱憩室腫瘤可能阻止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散到尿液。

這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，在特異性相同的情況下，UroVysion熒光原位雜交檢測(cè)比尿液細(xì)胞學(xué)檢查在檢測(cè)膀胱癌復(fù)發(fā)時(shí)具有更高的靈敏度。因此，UroVysion熒光原位雜交雜交法可成為篩選膀胱癌復(fù)發(fā)的工具之一。

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