丁 龍，陶 旭，張 燕，蘇 薇，陳 銘，劉 暢，劉靜波*

(吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130062)

雞蛋殼膜提取唾液酸過程中蛋白質(zhì)脫除工藝優(yōu)化

丁 龍，陶 旭，張 燕，蘇 薇，陳 銘，劉 暢，劉靜波*

(吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130062)

以雞蛋殼膜為原料，用乙醇沉淀法脫除蛋白質(zhì)以提取唾液酸。利用二次回歸中心組合設(shè)計(jì)對(duì)影響蛋白質(zhì)去除率和唾液酸回收率的乙醇體積分?jǐn)?shù)、加熱溫度、加熱時(shí)間、pH值4個(gè)因素進(jìn)行回歸分析和優(yōu)化，建立四元二次回歸模型。結(jié)果表明因素的影響大小順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞加熱溫度＞pH值＞加熱時(shí)間，確定最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、加熱溫度80℃、加熱時(shí)間1h、pH2。在此條件下，蛋白質(zhì)去除率為52.3%，唾液酸回收率為82.1%，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值吻合，說明建立的模型確實(shí)可行。

雞蛋殼膜；唾液酸；蛋白質(zhì)；響應(yīng)面法

唾液酸(sialic acid，SA)是一類神經(jīng)氨酸的衍生物，是以九碳酮糖酸-神經(jīng)氨酸為骨架，并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖，通常在糖蛋白和糖脂的末端以糖苷的形式存在[1]。唾液酸廣泛分布于自然界中，但以哺乳動(dòng)物大腦和乳液中含量最多[2]，因其與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[3]、記憶與學(xué)習(xí)能力形成[4]、細(xì)胞識(shí)別與信息傳遞[5]等有緊密聯(lián)系而成為研究熱點(diǎn)。唾液酸在分子生物學(xué)[6]和化學(xué)合成[7]中的研究已多見報(bào)導(dǎo)，但關(guān)于唾液酸的生物提取因其活性成分復(fù)雜、含量少而比較困難，Blix等[8]用較為溫和的水解方法從頜下腺黏蛋白中首先分離出了唾液酸，后來有Juneja等[9]從禽蛋的蛋黃膜和系帶中提取出唾液酸等，高劍峰等[10]曾報(bào)導(dǎo)了以豬血為原料提取唾液酸的工藝，李文強(qiáng)等[11]研究了從大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化得到聚唾液酸的工藝等。

我國是禽類養(yǎng)殖大國，雞蛋的食用多為傳統(tǒng)的直接食用方法，每年約有400萬噸廢棄雞蛋殼造成資源的浪費(fèi)以及生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重污染[12]。而雞蛋殼膜中唾液酸的含量相當(dāng)可觀，約為0.02%[13]，本實(shí)驗(yàn)以雞蛋殼膜為原料，經(jīng)過水解，然后用乙醇沉淀法除去水解液中占絕大部分的蛋白質(zhì)以提取唾液酸。采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、加熱溫度、加熱時(shí)間和pH值及其交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，通過建立四元二次回歸模型確定最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋殼 吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部學(xué)生一食堂；牛血清白蛋白(分子生物學(xué)級(jí)) 美國Amresco公司；唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Sigma公司；水合茚三酮、冰乙酸(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、鹽酸、硫酸(均為分析純) 北京化工廠；濃磷酸(分析純) 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；R-250型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；AG204型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；CR20B2型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；PHS-3B精密pH計(jì) 上海雷磁公司；FN-200高速萬能粉碎機(jī) 寧波薪芝公司；Cs501sp型超級(jí)恒溫器 上海虹錦屏有限公司通洲分公司。

1.3 方法

1.3.1 雞蛋殼膜中唾液酸提取工藝流程

雞蛋殼→清洗→殼膜分離→雞蛋殼膜→干燥、粉碎→水解→真空抽濾→減壓濃縮→乙醇沉淀蛋白→離心去沉淀→樣品

1.3.2 蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)

采用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量[14]。

1.3.4 因子貢獻(xiàn)率計(jì)算公式

式中：β為因子貢獻(xiàn)率/%；sj和fj分別為試驗(yàn)因素j的偏差平方和與自由度；se和fe分別為誤差的偏差平方和與自由度；s為總偏差平方和。

1.3.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

乙醇的加入能改變蛋白質(zhì)溶液的介電常數(shù)導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降，同時(shí)加熱能促使蛋白質(zhì)變性沉淀。本試驗(yàn)通過向減壓濃縮后的雞蛋殼膜水解液中加入適量無水乙醇，選擇無水乙醇添加量、加熱溫度、加熱時(shí)間和溶液pH值為試驗(yàn)因素。先以單因素試驗(yàn)初步確定對(duì)蛋白質(zhì)去除率有顯著影響的各因素水平范圍，然后進(jìn)行二次正交中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

1.3.5.1 單因素試驗(yàn)

固定加熱溫度8 0℃、p H 3、加熱時(shí)間1 h，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響，以確定適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、pH3、加熱時(shí)間1h，考察加熱溫度分別為50、60、70、80、90℃時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響，以確定適宜的加熱溫度。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、加熱溫度80℃、pH3，考察加熱時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5h時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響，以確定適宜的加熱時(shí)間。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、加熱溫度80℃、加熱時(shí)間1h，考察pH1、2、3、4、5時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響，以確定適宜的p H值。

1.3.5.2 二次正交中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

選擇4個(gè)因素χ1(乙醇體積分?jǐn)?shù))、χ2(加熱溫度)、χ3(加熱時(shí)間)、χ4(pH值)為自變量進(jìn)行組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)二次中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素編碼表，如表1所示，試驗(yàn)均按隨機(jī)順序進(jìn)行。利用Design Expert軟件中的Central Composite進(jìn)行乙醇體積分?jǐn)?shù)、加熱溫度、加熱時(shí)間和pH值4個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)去除率和唾液酸回收率的響應(yīng)面分析，并對(duì)獲得的回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

表1 雞蛋殼膜提取唾液酸過程中蛋白質(zhì)脫除工藝二次組合設(shè)計(jì)因素編碼表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)和唾液酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

吸光度A595與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(C)/(μg/mL)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A595＝0.0062C＋0.0859，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9978，吸光度A470與唾液酸質(zhì)量濃度(C)/(μg/mL)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A470＝0.0022C-0.0073，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9989，在試驗(yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，能滿足本試驗(yàn)需要。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

圖1 各因素對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響Fig.1 Effect of each factor on protein removal rate investigated by onefactor-at-a-time design

由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在20%～60%之間增加時(shí)，蛋白質(zhì)去除率有明顯增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)的蛋白質(zhì)去除率約是30%時(shí)的2倍；當(dāng)加熱溫度在50～90℃之間、pH值在1～5之間增大時(shí)，蛋白質(zhì)也有較明顯的增大，但增加幅度沒有乙醇體積分?jǐn)?shù)大；加熱時(shí)間在0.5～2.5h之間增大時(shí)，蛋白質(zhì)去除率呈上下波動(dòng)變化趨勢(shì)，且波動(dòng)幅度不明顯，說明加熱時(shí)間對(duì)乙醇去除率的影響不顯著。

2.3 回歸模型的建立

利用Design Expert軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸模型如下：

表2 雞蛋殼膜提取唾液酸過程中蛋白質(zhì)脫除工藝二次中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.1 回歸模型檢驗(yàn)

蛋白質(zhì)去除率回歸模型(式4)的方差分析表明(表3)，此模型的決定系數(shù)R2＝0.8337，響應(yīng)面回歸模型接近高度顯著水平(P＝0.0013)，逐步顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，交互項(xiàng)對(duì)回歸模型影響不顯著，二次項(xiàng)有顯著影響，一次項(xiàng)有極顯著影響，決定系數(shù)為0.5887，對(duì)回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明，χ3、χ1χ3、χ2χ3、χ2χ4、χ3χ4不顯著，χ1χ2、χ12、χ22、χ32在可以接受的水平，χ1、χ2、χ4、χ1χ4、χ42顯著，其中χ1為高度顯著性?；貧w模型失擬項(xiàng)P＝0.1110＞0.05，不顯著，說明該回歸模型能夠很好的擬合試驗(yàn)結(jié)果。

唾液酸回收率回歸模型(式5)的方差分析表明(表3)，此模型的決定系數(shù)R2＝0.9665，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到高度顯著水平(P＜0.0001)，逐步顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，交互項(xiàng)對(duì)回歸模型影響不顯著，二次項(xiàng)和一次項(xiàng)有極顯著影響，決定系數(shù)達(dá)到0.72641，對(duì)回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明，χ3、χ1χ4、χ3χ4、χ32不顯著，χ4、χ1χ2、χ2χ4在可以接受的水平，χ1、χ2、χ1χ3、χ2χ3、χ12、χ22、χ42均達(dá)到顯著性水平，且χ1、χ12為高度顯著性。回歸模型失擬項(xiàng)P＝0.8128＞0.05，不顯著，說明該回歸模型能夠很好的擬合試驗(yàn)結(jié)果。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the created regression models for protein removal rate and sialic acid recovery

2.4 回歸模型的分析

2.4.1 因子貢獻(xiàn)率

采用因子貢獻(xiàn)率來比較各因子對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的大小。各因子貢獻(xiàn)率見表4，可以看出，線性項(xiàng)和二次項(xiàng)是回歸模型的主導(dǎo)效應(yīng)。對(duì)于蛋白質(zhì)去除率，各試驗(yàn)因素的效應(yīng)影響大小順序?yàn)棣?(乙醇體積分?jǐn)?shù))＞χ4(pH值)＞χ2(加熱溫度)＞χ3(加熱時(shí)間)，對(duì)于唾液酸回收率，各試驗(yàn)因素的效應(yīng)影響大小順序?yàn)棣?(乙醇體積分?jǐn)?shù))＞χ2(加熱溫度)＞χ4(pH值)＞χ3(加熱時(shí)間)。

表4 各因子貢獻(xiàn)率表Table 4 Contribution rate of each term in the created regression models to protein removal rate and sialic acid recovery

2.4.2 單因素效應(yīng)分析

圖2 各單因素水平與蛋白質(zhì)去除率的回歸曲線Fig.2 Effect of each factor on protein removal rate investigated based on the created regression model

由因子貢獻(xiàn)率分析得到，對(duì)回歸模型影響最大的是各因素的一次效應(yīng)，即單因素?？刂?個(gè)因素中的3個(gè)因素在零水平，分別得到各個(gè)因素的單因素模型，各因素的單因素效果圖見圖2、3。從圖2、3可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、加熱溫度和pH值的增大，蛋白質(zhì)去除率隨著增大，但唾液酸的回收率卻隨之降低，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蛋白質(zhì)去除率和唾液酸的回收率的作用均最顯著，加熱溫度和pH值次之，而加熱時(shí)間的變化對(duì)蛋白質(zhì)去除率和唾液酸回收率幾乎沒有影響。

圖3 各單因素與唾液酸回收率的回歸曲線Fig.3 Response surface plots showing the interactive effects of four factors on protein removal rate

2.4.3 交互作用效應(yīng)分析

圖4 各交互因素對(duì)蛋白質(zhì)去除率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of four factors on sialic acid recovery

以蛋白質(zhì)去除率為響應(yīng)值，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、加熱溫度、加熱時(shí)間和pH值4個(gè)因素作響應(yīng)面圖，見圖4。從圖4可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)與加熱溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)與pH值的交互效應(yīng)最顯著，在試驗(yàn)考查范圍內(nèi)同時(shí)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)與加熱溫度、增大乙醇體積分?jǐn)?shù)與pH值均能使蛋白質(zhì)去除率迅速增大，并接近最大值，而且響應(yīng)值對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化比加熱溫度和pH值都要敏感很多，其最優(yōu)點(diǎn)分別趨近于乙醇體積分?jǐn)?shù)70%與加熱溫度80℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%與pH6。其他交互作用效應(yīng)并不很顯著，其最優(yōu)點(diǎn)分別為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%與加熱時(shí)間1h、加熱溫度80℃與加熱時(shí)間1h、加熱溫度80℃與pH6、加熱時(shí)間1h與pH6，并且響應(yīng)值分別在這些點(diǎn)附近達(dá)到最大值。

以唾液酸回收率為響應(yīng)值，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、加熱溫度、加熱時(shí)間和pH值4個(gè)因素作響應(yīng)面圖，見圖5。從圖5可以看出乙醇體積分?jǐn)?shù)與加熱溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)與加熱時(shí)間、加熱溫度與加熱時(shí)間、加熱溫度與pH值的交互效應(yīng)顯著，響應(yīng)值對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化最為敏感，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大時(shí)，響應(yīng)值顯著減小，即在試驗(yàn)范圍內(nèi)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)越小時(shí)，唾液酸回收率越高。同時(shí)減小乙醇體積分?jǐn)?shù)與加熱溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)與pH值對(duì)唾液酸回收率的促進(jìn)均有顯著作用。

圖5 各交互因素對(duì)唾液酸回收率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of each factors on the sialic acid recovery rate

2.5 回歸模型尋優(yōu)

分別對(duì)蛋白質(zhì)去除率和唾液酸回收率的四元二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，蛋白質(zhì)去除率的最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)52.6%、加熱溫度79.6℃、加熱時(shí)間1.1h、pH2.2，預(yù)測(cè)的最大蛋白質(zhì)去除率為54.9%；唾液酸回收率的最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)51.9%、加熱溫度77.4℃、加熱時(shí)間0.7h、pH3.9，預(yù)測(cè)的最低唾液酸回收率為66.57%。而利用Design Expert Numerical Optimization對(duì)蛋白質(zhì)去除率和唾液酸回收率的回歸模型進(jìn)行尋優(yōu)，得到使蛋白質(zhì)去除率最大時(shí)的工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)66.4%、加熱溫度61.5℃、加熱時(shí)間0.7h、pH6.0，蛋白質(zhì)去除率為71.0%，使唾液酸回收率最大的工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)23.7%、加熱溫度47.5℃、加熱時(shí)間1.3h、pH2.3，唾液酸回收率接近100%。由于乙醇對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響最大，要使蛋白質(zhì)有較大的去除率，就必須使用比較大的乙醇體積分?jǐn)?shù)，而較大的乙醇體積分?jǐn)?shù)又會(huì)造成唾液酸回收率的下降[16]，因此綜合考慮蛋白質(zhì)去除率和唾液酸回收率，結(jié)合實(shí)際，確定比較合適的工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、加熱溫度80℃、加熱時(shí)間1h、pH2，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)的去除率為52.3%，唾液酸回收率為82.1%。

3 結(jié) 論

利用二次正交中心組合設(shè)計(jì)，通過Design Expert軟件中的 Central Composite對(duì)影響蛋白質(zhì)去除率和唾液酸回收率的乙醇體積分?jǐn)?shù)、加熱溫度、加熱時(shí)間、pH值4個(gè)因素進(jìn)行回歸分析和優(yōu)化，經(jīng)F檢驗(yàn)，該回歸模型不失擬，能很好地?cái)M合雞蛋殼膜水解液提取唾液酸反映的真實(shí)情況，因子貢獻(xiàn)率分析表明，各因素對(duì)唾液酸提取的影響大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞加熱溫度＞pH值＞加熱時(shí)間，最后綜合考慮蛋白質(zhì)去除率和唾液酸回收率，結(jié)合實(shí)際情況，得出唾液酸提取的最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、加熱溫度80℃、加熱時(shí)間1h、pH2。這與李文強(qiáng)等[11]曾報(bào)導(dǎo)的發(fā)酵液中聚唾液酸分離純化過程中除蛋白質(zhì)的研究結(jié)果較為接近，所添加乙醇體積分?jǐn)?shù)的不同可能是由于雞蛋殼膜水解液中聚唾液酸的含量較少，而唾液酸單體較多。

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Deproteinization Optimization for Sialic Acid Extraction from Eggshell Membranes by Response Surface Methodology

DING Long，TAO Xu，ZHANG Yan，SU Wei，CHEN Ming，LIU Chang，LIU Jing-bo*
(Laboratory of Nutrition and Functional Food, Jilin University, Changchun 130062, China)

In this study, eggshell membranes were used as the raw material to extract sialic acid based on deproteinization by ethanol precipitation. A four-factor, five-level central composite design combined with multiple regression analysis was employed to mathematically model protein removal rate and sialic acid recovery as a response to ethanol concentration, temperature, heating time and pH, respectively. Ethanol concentration was identified to be the most significant affecting factor, followed by temperature, pH and heating time. The optimal deproteinization conditions were determined to be: ethanol concentration 30%, temperature 80 ℃, heating time 1 h and pH 2. Under these conditions, the removal rate of protein was predicted to be 52.3% and the recovery of sialic acid 82.1%, closely agreeing with the experimental values, respectively. Thus, the created models are reliable.

eggshell membranes；sialic acid；protein；response surface methodology

TS253.1

：A

1002-6630(2011)20-0114-07

2011-06-28

吉林大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”項(xiàng)目(2010B83176)

丁龍(1988—)，男，本科生，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與功能性食品。E-mail：dinglong178@126.com

*通信作者：劉靜波(1962—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與功能性食品。E-mail：ljb168@sohu.com