周巖,薛曉鋒,趙俊杰,賀杰

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003）

作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展

周巖,薛曉鋒,趙俊杰,賀杰

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003）

綜述了當(dāng)前作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的三大主流方法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法等在農(nóng)作物遺傳改良中的研究進(jìn)展,并闡述了這些轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻、小麥、棉花、玉米、大豆、苜蓿等主要農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化現(xiàn)狀.著重論述了作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在抗病蟲、抗逆、品質(zhì)改良、雄性不育等方面對(duì)作物進(jìn)行遺傳改良的最新研究進(jìn)展.

作物;轉(zhuǎn)基因技術(shù);研究進(jìn)展

自1983年第一株轉(zhuǎn)基因作物誕生以來,作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了迅速發(fā)展.截至目前,幾乎所有的作物都開展了轉(zhuǎn)基因研究,育種目標(biāo)涉及到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效兼抗性及多用途等諸多方面.一批抗病、抗蟲、抗逆、抗除草劑等轉(zhuǎn)基因作物已進(jìn)入商品化生產(chǎn)階段.

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將具有重要利用價(jià)值的、外源的DNA片斷導(dǎo)入植物基因組中使之產(chǎn)生變異從而獲得新的特異性.大量轉(zhuǎn)基因作物的研究表明,作物基因工程是在基因水平上對(duì)作物的遺傳物質(zhì)的改造,定向地對(duì)作物遺傳性狀進(jìn)行改造,擴(kuò)展了育種范圍,打破了物種間的生殖隔離障礙,豐富了基因資源,使育種具有科學(xué)性、精確性、目的性和可操作性.作物遺傳轉(zhuǎn)化的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電激法、PEG法、脂質(zhì)體法、低能離子束法、超聲波介導(dǎo)法、顯微注射法、花粉管通道法等.在當(dāng)前作物基因工程研究中,主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法,這三種轉(zhuǎn)基因技術(shù)相對(duì)較為成熟.其他幾種方法雖然也應(yīng)用于作物轉(zhuǎn)基因,但是由于技術(shù)本身的限制及其他原因,報(bào)道的轉(zhuǎn)基因植株較少.本文主要論述了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法在作物基因工程上的最新進(jìn)展,綜述了主要農(nóng)作物在抗病蟲、抗逆、改良品質(zhì)、抗除草劑以及雄性不育等方面的研究現(xiàn)狀.

1 作物遺傳轉(zhuǎn)化方法

1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是利用根癌農(nóng)桿菌上的Ti質(zhì)粒,將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞核基因組中并進(jìn)行整合表達(dá)的轉(zhuǎn)化方法.其基本原理為：植物受到創(chuàng)傷后,細(xì)胞合成并分泌如乙酰丁香酮等類的酚類化合物,它們作為信號(hào)物質(zhì),促使農(nóng)桿菌附著到受傷植物細(xì)胞表面.這些酚類化合物能誘導(dǎo)農(nóng)桿菌的Vir區(qū)基因活化,T-DNA復(fù)制,Vir區(qū)編碼的特異蛋白與T-DNA結(jié)合形成T鏈蛋白復(fù)合體,跨越農(nóng)桿菌、植物細(xì)胞壁進(jìn)入核膜,整合至植物基因組DNA中.1983年比利時(shí)科學(xué)家Montagu等人和美國(guó)Monsanto公司Fraley等人分別將T-DNA上的致瘤基因切除并代之以外源基因,獲得了世界上第一株轉(zhuǎn)基因植株——轉(zhuǎn)基因煙草,首次證明可以通過Ti質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)χ参锛?xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其費(fèi)用低、重復(fù)性好、單拷貝數(shù)、基因沉默現(xiàn)象少、轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)而備受科學(xué)工作者的青睞,隨后不同的研究者利用該方法先后獲得了胡蘿卜、牽?；?、番茄和油菜等雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因植株.

1985年Horsch等創(chuàng)立葉盤法進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化,利用根癌農(nóng)桿菌侵染煙草、番茄和矮牽牛葉片,成功獲得了轉(zhuǎn)基因植物.該方法簡(jiǎn)單高效,為植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化開創(chuàng)了新途徑.雙子葉植物是根癌農(nóng)桿菌的天然寄主,該方法在雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中得到了廣泛的應(yīng)用,已成為大多數(shù)植物轉(zhuǎn)基因的首選方法.蘇玉春等以木聚糖酶xynB基因?yàn)橥庠椿?利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化紫花苜蓿,獲得了整合有外源基因的再生植株,且鮮葉片木聚糖酶活性為10.5U/g[1].

由于單子葉植物不是根癌農(nóng)桿菌的天然寄主,體內(nèi)很少或者很難產(chǎn)生激活Ti質(zhì)粒上Vir基因的信號(hào)分子,大多數(shù)沒有明顯的創(chuàng)傷反應(yīng),不能誘導(dǎo)創(chuàng)傷區(qū)臨近的細(xì)胞脫分化形成大量感受態(tài)細(xì)胞,對(duì)農(nóng)桿菌感染不敏感,因而使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物很難獲得成功.研究表明,乙酰丁香酮等酚類化合物可以促進(jìn)農(nóng)桿菌在水稻、玉米、小麥、谷子培養(yǎng)細(xì)胞及幼苗上吸附,從而有效地提高轉(zhuǎn)化效率[2].農(nóng)桿菌菌株類型、轉(zhuǎn)化材料年齡及生理狀態(tài)也是影響轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵因素.經(jīng)過改良后的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法在一些重要的單子葉作物如水稻、玉米、小麥等成功獲得轉(zhuǎn)基因植株后,根癌農(nóng)桿菌侵染單子葉的遺傳轉(zhuǎn)化研究迅速發(fā)展起來,并逐步獲得了一部分作物轉(zhuǎn)基因植株或品系.王秀紅等利用該方法將新型抗草甘膦基因?qū)胗衩變?yōu)良再生材料Hi-Ⅱ中,獲得了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米[3].

1.2 基因槍法

基因槍法又稱為微彈轟擊法,其原理是外源DNA包被在微小的金?；蜴u粉中,以火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體為驅(qū)動(dòng)力,將附著于其表面的外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞,然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)再生出整合有外源DNA的新植株.最早的基因槍是由美國(guó)Cornel大學(xué)的Sanford等在1987年研制成功的.同年,Klein首次利用基因槍法轉(zhuǎn)化玉米；1989年采用該方法將GUS和PAT基因?qū)胗衩讘腋〖?xì)胞系,獲得了轉(zhuǎn)基因玉米[4].研究發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)化過程中加入氯化鈣和亞精胺能提高核酸與微彈的結(jié)合力,選擇合適的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體及受體組織,優(yōu)化基因槍轟擊參數(shù)（轟擊次數(shù)、轟擊時(shí)金粉用量、轟擊距離、DNA濃度、氦氣壓力和微彈速度等）可有效提高基因槍的轉(zhuǎn)化效率[5].伍成祥等利用基因槍將連有MAR序列的bar基因?qū)胨精@得抗性植株[6].余桂容等研究表明,金粉用量100μg/槍,發(fā)射點(diǎn)與靶細(xì)胞距離60mm,可提高玉米基因槍的轉(zhuǎn)化效率[7].

自基因槍法建立以來,有力地推動(dòng)了作物基因工程的發(fā)展,采用該方法已成功將抗病、抗蟲、抗逆、品質(zhì)改良等基因?qū)胱魑锘蚪M中.基因槍法對(duì)一些難以再生的作物更實(shí)用,幼胚、花粉細(xì)胞、莖尖分生組織等均可作為受體材料.基因槍法以其受體來源廣泛,方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),成為迄今為止單子葉作物轉(zhuǎn)基因的主要方法,且轉(zhuǎn)化的方法也相對(duì)比較成熟.然而基因槍法仍存在一些不足,如易形成嵌合體,多基因拷貝的整合,易出現(xiàn)共抑制和基因沉默現(xiàn)象,而且基因槍法所用的儀器設(shè)備昂貴,也限制其廣泛應(yīng)用.

1.3 花粉管通道法

上世紀(jì)70年代,周光宇等結(jié)合我國(guó)遠(yuǎn)緣雜交的成功經(jīng)驗(yàn),提出了DNA片段雜交假說,為建立花粉管通道法奠定了重要的理論基礎(chǔ).而后周光宇等從分子水平上加以驗(yàn)證,模擬授粉雜交設(shè)計(jì)出花粉管通道轉(zhuǎn)基因技術(shù),成功地將外源海島棉D(zhuǎn)NA導(dǎo)入陸地棉,培育出抗枯萎病的栽培品種,正式創(chuàng)立花粉管通道法.該方法是在植物授粉后,將含有目的外源基因的DNA溶液注射或涂抹到子房,利用植物開花,受精形成的花粉管通道,將外源的DNA導(dǎo)入到受精的卵細(xì)胞中,最終整合到植物基因組中,伴隨著受精卵的發(fā)育而形成轉(zhuǎn)基因新個(gè)體.盡管花粉管通道法獲得的轉(zhuǎn)基因植株,在性狀方面的確發(fā)生了明顯的變異,但由于缺乏確切的分子生物學(xué)證據(jù),致使國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)其可靠性提出了質(zhì)疑.龔蓁蓁等利用同位素示蹤法表明通過3′H-DNA標(biāo)記的棉花總DNA經(jīng)珠孔進(jìn)入開放的珠心到達(dá)胚后,30 s～8 h之間取樣放射自顯影觀察,80%以上的胚囊2～4 h均有外源DNA進(jìn)入.在進(jìn)入胚囊的途徑中,自顯斑點(diǎn)主要集中在珠心孔道內(nèi)——即花粉管通道,在花粉管通道以外的珠心組織無標(biāo)記顯示,表明授粉后形成的花粉管通道是外源DNA進(jìn)入胚囊的唯一途徑[8].1988年Luo和Wu首次利用花粉管通道法將含報(bào)告基因的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入水稻,經(jīng)Southern雜交和酶學(xué)測(cè)定證明,得到了外源基因整合并表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻植株[9],從而使花粉管通道法得到分子水平驗(yàn)證.自此,外源DNA導(dǎo)入技術(shù)的研究工作在多種植物中陸續(xù)開展起來,已在水稻、小麥、棉花、玉米、大豆等作物育種中得到了成功應(yīng)用,培育了許多具有抗病蟲、抗逆及其他優(yōu)良性狀的作物新品種或新品系.董春林等采用改進(jìn)的花粉管通道法,將海藻糖合酶基因（TPS）導(dǎo)入玉米自交系鄭58中,獲得了抗旱性高于對(duì)照的轉(zhuǎn)化植株[10].

花粉管通道法最突出的優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株,技術(shù)簡(jiǎn)單,不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室,常規(guī)育種工作者易于掌握等.然而由于受到轉(zhuǎn)化時(shí)間、轉(zhuǎn)化時(shí)溫度和濕度、轉(zhuǎn)化載體的DNA濃度及受體植株花粉發(fā)育狀態(tài)的影響,目前該方法的轉(zhuǎn)化效率仍然較低.外源DNA片段與受體染色體組交換和重組的隨機(jī)性決定了轉(zhuǎn)基因后代變異性狀也有很大的隨機(jī)性和多向性.外源DNA導(dǎo)入引起變異的種類多、范圍廣、幅度大,使得對(duì)后代的篩選變得很復(fù)雜.

2 主要作物基因工程的研究現(xiàn)狀

2.1 轉(zhuǎn)基因水稻

水稻是世界的主要糧食作物之一,世界上有二分之一以上的人口以稻米為主食.自1988年獲得第一批轉(zhuǎn)基因水稻以來,研究者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)的水稻進(jìn)行改良,成功地獲得了許多具有高產(chǎn)、抗性、營(yíng)養(yǎng)乃至藥用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因水稻.1991年Christou等利用基因槍法轟擊水稻幼胚,獲得轉(zhuǎn)基因秈稻和粳稻植株,并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化性狀能傳遞到子代并符合孟德爾遺傳分離規(guī)律,同時(shí)利用分子生物學(xué)雜交證實(shí)了外源基因已穩(wěn)定整合到子代植株中[11].Ignacimuthu等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來源于菜豆種子的淀粉酶阻抑基因?qū)隑asmati水稻中,獲得了174株潮霉素抗性植株且呈GUS陽性反應(yīng),PCR和Southern bolts雜交證實(shí)淀粉酶阻抑基因已整合至水稻中,Western印記雜交證明相關(guān)蛋白已表達(dá).除抗除草劑、改良品質(zhì)基因外,抗病蟲、抗逆基因、高產(chǎn)以及與C4光合作用相關(guān)的PEPC基因等都已應(yīng)用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化[12].

2.2 轉(zhuǎn)基因小麥

1992年Vasil利用長(zhǎng)期培養(yǎng)的胚性愈傷組織為外植體,通過基因槍法將Gus/Bar基因?qū)胄←溒贩N“pavn”,獲得對(duì)除草劑Basra具有抗性的再生植株（T0）及其后一代（T1）,從而獲得了世界上第一株轉(zhuǎn)基因小麥[13].基因槍轉(zhuǎn)基因技術(shù)的誕生,為小麥基因工程遺傳改良提供了新途徑.迄今為止,基因槍法仍是國(guó)際上小麥轉(zhuǎn)基因的主要方法.然而,其他轉(zhuǎn)基因技術(shù)在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中也發(fā)揮著重要作用,并取得了一系列成果.劉香利等利用花粉管通道法將高分子量麥谷蛋白14亞基基因整合到不含該亞基的小麥品種[14]. Daniel等利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GBSS（I限制性淀粉粒合成酶）基因?qū)胄←溣着咧?Southern bolts雜交分析確定了外源基因已整合至小麥基因組中[15].

2.3 轉(zhuǎn)基因棉花

自1987年Umbeck等首次報(bào)道利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將NPTII基因和CAT基因?qū)腙懙孛奁贩N珂字312、310以來,棉花基因工程研究快速發(fā)展[16].中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心郭三堆等利用花粉管通道法,將構(gòu)建的植物表達(dá)載體pGBI121S4ABC（攜帶高效雙價(jià)殺蟲基因CryIA和CpTI）導(dǎo)入石遠(yuǎn)321、中棉所19號(hào)等黃淮海棉區(qū)主栽的棉花品種中,首次獲得了雙價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉株系[17].目前,棉花基因工程研究主要集中在抗病害、抗除草劑方面.王振怡等利用基因槍轟擊陸地棉“邯208”的成熟種子胚尖,將抗黃萎病相關(guān)基因GhDAHPS轉(zhuǎn)化到棉花中,獲得了抗性植株[18].郭彩菊等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,將含有根特異性表達(dá)啟動(dòng)子的植酸酶基因（PhyA）轉(zhuǎn)入棉花的胚性愈傷中,PCR檢測(cè)證明PhyA已整合到棉花基因組中[19].

2.4 轉(zhuǎn)基因玉米

自1989年Klein[4]首次獲得轉(zhuǎn)基因玉米以來,玉米的遺傳轉(zhuǎn)化取得突破性進(jìn)展,目前已建立了一套比較完整的理論和技術(shù)體系.玉米基因工程在抗病蟲害、抗除草劑、改良品質(zhì)等方面研究十分廣泛. Schnepf等首次成功地克隆了一個(gè)編碼為Bt的殺蟲晶體蛋白基因,它在植物體內(nèi)能合成毒素蛋白,害蟲吃過毒素蛋白后就會(huì)死亡,該基因成功地開啟了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕[20].Koziel等利用基因槍法將Cry1b基因轉(zhuǎn)入玉米幼胚,培育出抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米[21].關(guān)淑艷等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將淀粉分支酶基因sbe2a的RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)入玉米自交系H99和丹598胚性愈傷組織,PCR檢測(cè)初步證明外源基因已整合至玉米基因組中[22].

2.5 其他轉(zhuǎn)基因作物

大豆、苜蓿等作物基因工程研究與上述四大作物同步,目前已培育出了數(shù)千份具有各類特殊性狀的作物轉(zhuǎn)基因新材料.1988年Hinchee首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因大豆[23].自此,大豆遺傳轉(zhuǎn)化的外源基因覆蓋了抗蟲、抗除草劑及品質(zhì)改良等方面,且在優(yōu)化組織再生條件、提高遺傳轉(zhuǎn)化效率、去除選擇標(biāo)記等方面獲得了突破性的進(jìn)展.葉美等以“荷豆12”成熟種子胚尖為外植體,利用基因槍法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,基因槍轉(zhuǎn)化后的胚尖組織和轉(zhuǎn)基因植株后代的葉片中均觀察到GUS基因的表達(dá)；PCR證明外源GUS基因插入到轉(zhuǎn)基因后代的基因組中[24].張立全等利用花粉管通道法將鹽生植物紅樹總DNA導(dǎo)入紫花苜蓿阿爾岡金,獲得了在225mmol/LNaCl脅迫條件下具有高耐鹽性的植株[25].

3 結(jié)語

作物基因工程研究開展近三十年來,已取得了可喜成績(jī).全世界分離出的目的基因已達(dá)100多個(gè),獲得的轉(zhuǎn)基因植物達(dá)200多種.玉米、大豆、棉花、油菜轉(zhuǎn)基因作物等均已在田間釋放并在全球大面積種植.2010年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積14 800萬hm2.作物基因工程育種為獲得新種質(zhì)資源以及具優(yōu)良農(nóng)藝性狀的品系提供了合理有效的新途徑.然而作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)還普遍存在著作物遺傳轉(zhuǎn)化體系不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化效率低、外源基因表達(dá)量低或不表達(dá)、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差等問題.因此,今后的發(fā)展方向仍然是圍繞著提高轉(zhuǎn)化效率,克服基因表達(dá)后沉默等問題.我們相信隨著基因工程的進(jìn)一步發(fā)展,尤其是轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化機(jī)理、轉(zhuǎn)化策略等不斷完善,轉(zhuǎn)基因技術(shù)將在作物遺傳改良中發(fā)揮越來越重要的作用.

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Advances in crop genetic engineering research

Zhou Yan,Xue Xiaofeng,Zhao Junjie,He Jie
（Henan Instituteof Scienceand Technology,Xinxiang453003,China）

The researsh of crop genetic engineering have extensively developed and gradually become effective complement of the conventional breeding.This paper briefly reviews current progress in the development of research and applications inmain crop transgenic breeding;summarizesmain transgenetic techniqueswidely used inmain crop breeding（e.g.rice,wheat,cotton,maize,soybean and alfalfa）,such as Agrobacterium-mediated transformation,particle bombardment,pollen tube pathway.Illustrates the advanced progress in the applications of crop genetic improvement, including diseases and insects resistance,quality improvment,abiotic stresses tolerance,male sterility and some other aspects.

crop,transgenic technology,advance

Q789

A

1008-7516（2011）05-0001-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2011.05.001

2011-08-12

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（072300430120）

周巖（1962-）,女,河南新鄉(xiāng)人,博士,教授.主要從事植物基因組學(xué)及分子生物學(xué)研究.

鄧天福）