馮書營 ,劉 岷 ,谷輝輝

(1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院,河南洛陽 471003;2.河南省中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,河南鄭州 450000;3.鄭州大學(xué)生物工程系,河南鄭州 450001)

0 前言

鹽藻是生活在海洋中的一種單細(xì)胞真核綠藻,其自身無毒無害、營養(yǎng)價值高,又屬于真核生物、無細(xì)胞壁,便于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化以生產(chǎn)外源性蛋白[1-2],目前已被開發(fā)作為一種新型的生物反應(yīng)器[3]。該新型生物反應(yīng)器在生產(chǎn)外源性功能蛋白時,遺傳轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)成為其主要限制性因素之一。關(guān)于鹽藻的轉(zhuǎn)化研究有文獻(xiàn)報道,其轉(zhuǎn)化方法有基因槍法[4]和電擊法[5],但二者方法都存在操作繁瑣、轉(zhuǎn)化率低等缺點,限制了二者的應(yīng)用。鑒于該研究現(xiàn)狀,本文作者借鑒于其他藻類的轉(zhuǎn)化方法[6],在鹽藻中建立起新型的玻璃珠轉(zhuǎn)化法,并實現(xiàn)了外源報告基因 GUS的有效表達(dá)[7]。結(jié)合前期工作基礎(chǔ),本文進(jìn)行了玻璃珠法與基因槍法、電擊法等不同方法的對比研究,在轉(zhuǎn)化效率、細(xì)胞損傷程度以及各方法優(yōu)缺點等方面進(jìn)行了比較,旨在確立一種最為適合鹽藻反應(yīng)器的轉(zhuǎn)化方法。同時,對可能影響鹽藻玻璃珠轉(zhuǎn)化效率的若干因素進(jìn)行了分析探討,為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率和盡早實現(xiàn)外源基因在鹽藻中的高效表達(dá)提供有力工具和借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鹽藻細(xì)胞及其培養(yǎng)條件

鹽藻藻株購自美國德州大學(xué),培養(yǎng)基為 PKS液體培養(yǎng)基[8]。培養(yǎng)條件為:溫度 26℃;光暗比14∶10;光照強(qiáng)度為50 lx。實驗所用鹽藻細(xì)胞是固體培養(yǎng)基上挑取單藻落,接種 5 mL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d,然后擴(kuò)大培養(yǎng)至細(xì)胞濃度 106個/m L備用。

1.1.2 轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒

轉(zhuǎn)化所用表達(dá)質(zhì)粒為pBI221-bar,由中國科學(xué)院遺傳研究所孫勇如教授惠贈。該質(zhì)粒包含報告基因GUS和篩選標(biāo)記BAR盒,用于篩選實驗和染色觀察,二者均由CaMV35S啟動子驅(qū)動,結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.1.3 主要儀器及實驗耗材

圖1 質(zhì)粒pBI221-bar結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 方法

鹽藻的轉(zhuǎn)化分別采用基因槍法[4]、電擊法[5]和玻璃珠法[7]3種方法進(jìn)行,轉(zhuǎn)化后按照J(rèn)efferson法[9]對細(xì)胞進(jìn)行固定染色,鏡檢觀察,計算轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)。在轉(zhuǎn)化實驗中,每實驗組設(shè)有 3組重復(fù),實驗重復(fù) 3次。同時,實驗設(shè)有陰性對照組,即沒有加入質(zhì)粒,其余操作過程均相同的處理組。

鹽藻在進(jìn)行 3種不同方法轉(zhuǎn)化時,分別在轉(zhuǎn)化后的 12 h、24 h、36 h和 48 h計算空白組(即沒有加入質(zhì)粒,又沒有進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作的對照組)與各個轉(zhuǎn)化組的細(xì)胞存活數(shù)目,比較不同轉(zhuǎn)化方法對細(xì)胞的損傷程度的最低。

此外,為獲得更加理想的轉(zhuǎn)化結(jié)果,對玻璃珠法的轉(zhuǎn)化過程操作、轉(zhuǎn)化過程中轉(zhuǎn)化試劑的選擇和注意事項、鹽藻的生長狀態(tài)和生長階段等關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行了相關(guān)探討。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析

無論在不同轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率的比較實驗中,還是在轉(zhuǎn)化方法對鹽藻損傷程度分析性實驗中,其細(xì)胞的轉(zhuǎn)化數(shù)和細(xì)胞存活數(shù)均采用統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS 11.0進(jìn)行了 t檢驗處理,檢驗水準(zhǔn) P＜0.01,記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不同轉(zhuǎn)化方法對鹽藻的轉(zhuǎn)化結(jié)果

采用基因槍法、電擊法和玻璃珠法對鹽藻分別進(jìn)行了轉(zhuǎn)化,均取得了陽性轉(zhuǎn)化結(jié)果。經(jīng)組織化學(xué)染色后鏡檢觀察,未轉(zhuǎn)化的陰性對照組細(xì)胞呈淺黃色(見圖2a);而轉(zhuǎn)化的陽性細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色(見圖2b,箭頭所示),說明外源質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入鹽藻細(xì)胞,并且得到了有效表達(dá)。雖然 3種轉(zhuǎn)化方法均有陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的獲得,但轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)目差別很大。通過對每種轉(zhuǎn)化方法陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的計數(shù),轉(zhuǎn)化率以轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)/轉(zhuǎn)化總細(xì)胞數(shù)表示,玻璃珠法轉(zhuǎn)化率最高,能夠達(dá)到59%;基因槍法轉(zhuǎn)化率最低,僅有0.01%;電擊法轉(zhuǎn)化率居中,約為 2%。造成轉(zhuǎn)化率差異如此之大的主要原因與各種方法對細(xì)胞的損傷程度不一樣有關(guān)。為此,本研究接下來進(jìn)行了 3種方法對細(xì)胞的損傷性分析。

圖2 GUS基因在鹽藻細(xì)胞表達(dá)后的組織化學(xué)染色(400×)

2.2 不同轉(zhuǎn)化方法對鹽藻細(xì)胞的損傷性分析

用 3種轉(zhuǎn)化方法分別對鹽藻進(jìn)行轉(zhuǎn)化后,結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出:空白組沒有進(jìn)行任何轉(zhuǎn)化處理操作,鹽藻數(shù)目隨著培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞數(shù)目在逐漸的增加。玻璃珠轉(zhuǎn)化組在轉(zhuǎn)化后的 12 h時,細(xì)胞數(shù)量變化不明顯,存活細(xì)胞數(shù)約為90%,在隨后培養(yǎng)的 36 h中,細(xì)胞數(shù)目變化也不明顯,呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢。電擊轉(zhuǎn)化組在轉(zhuǎn)化后的 12 h時,細(xì)胞數(shù)量的減少明顯低于玻璃珠法轉(zhuǎn)化組,但高于基因槍轉(zhuǎn)化組,約有 58%的細(xì)胞存活。基因槍轉(zhuǎn)化組在轉(zhuǎn)化后的 12 h時,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,下降幅度最大,存活細(xì)胞數(shù)僅占 26%。由此可見,玻璃珠法轉(zhuǎn)化后鹽藻細(xì)胞存活數(shù)最高,電擊法次之,基因槍法最低,這與三者方法的轉(zhuǎn)化率高低是相對應(yīng)的,直接反映出 3種方法轉(zhuǎn)化率不同的原因所在。

圖3 不同轉(zhuǎn)化方法對鹽藻細(xì)胞存活數(shù)目的影響

2.3 影響鹽藻玻璃珠轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率的其他因素分析

玻璃珠轉(zhuǎn)化法原理是利用微小玻璃珠在旋轉(zhuǎn)體系中對宿主細(xì)胞的研磨作用,使得在細(xì)胞表面造成小而短暫的孔隙,以便外源基因進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)而得以表達(dá)。在鹽藻的玻璃珠法轉(zhuǎn)化過程中,玻璃珠直徑大小、使用量和處理方法等方面的選擇對轉(zhuǎn)化結(jié)果都有著較大的影響。選擇直徑0.5mm左右的玻璃珠,取占轉(zhuǎn)化體積 30%左右的玻璃珠量對轉(zhuǎn)化較為有利[6]。轉(zhuǎn)化前玻璃珠的處理要科學(xué)規(guī)范,使用濃酸浸泡數(shù)小時后高溫烘干,達(dá)到潔凈玻璃珠表面,去除污物和油污的影響,進(jìn)而增加玻璃珠的摩擦作用。在轉(zhuǎn)化過程中試劑的添加也較為重要,如聚乙二醇(PEG)的使用,PEG具有較強(qiáng)的聚合作用,在外源質(zhì)粒經(jīng)細(xì)胞表面的孔隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后,能夠使其與細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)粘合,增加附著力,易于質(zhì)粒與細(xì)胞基因組的整合。為此,在轉(zhuǎn)化中選擇合適類型的PEG以及PEG的濃度顯得十分重要。選擇聚合作用強(qiáng)、性能穩(wěn)定的PEG產(chǎn)品較為有利,如PEG6000或PEG8000等。同時,PEG的使用濃度過低或過高都會造成轉(zhuǎn)化率下降[7]。

鹽藻細(xì)胞不同的生長階段對轉(zhuǎn)化率同樣有著較大的影響。鹽藻細(xì)胞的生長階段可分為生長緩慢期、生長快速期和生長穩(wěn)定期 3個時期,呈典型的 S型生長曲線[10]。在生長緩慢期,鹽藻細(xì)胞生長緩慢,生命力不強(qiáng),運(yùn)動較活潑;而進(jìn)入生長快速期時,細(xì)胞生長旺盛,運(yùn)動活潑,細(xì)胞呈較大的橢圓形、綠色,生命力最強(qiáng),容易吸收和容納外界物質(zhì)(見圖4a);到生長穩(wěn)定期時,細(xì)胞生長基本上處于停滯狀態(tài),運(yùn)動受限,細(xì)胞呈圓形,顏色淺黃(見圖4b)。為此,選擇處于生長快速期的細(xì)胞對獲得高轉(zhuǎn)化率有利。在實際研究工作中,大量的轉(zhuǎn)化實驗研究證實了該點結(jié)果。同時,在收集鹽藻細(xì)胞時,細(xì)胞的分層也要把握好。選擇懸浮于培養(yǎng)瓶中上層的細(xì)胞為好,該層細(xì)胞運(yùn)動活潑,代謝旺盛,易于轉(zhuǎn)化工作。處于中下層的細(xì)胞,由于其聚集作用的產(chǎn)生,運(yùn)行性較差,生長受限等原因,不宜選擇。

圖4 處于不同生長階段的鹽藻細(xì)胞形態(tài)(400×)

3 討論

鹽藻作為一種新型的生物反應(yīng)器,當(dāng)前受轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)的影響大大限制了鹽藻反應(yīng)器的開發(fā)利用。為此,確立一種高效的轉(zhuǎn)化方法是當(dāng)前亟待解決的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為克服當(dāng)前存在的基因槍法和電擊法的不足之處,作者嘗試建立起了鹽藻的玻璃珠轉(zhuǎn)化法[7]。但該方法沒有與基因槍法、電擊法進(jìn)行系統(tǒng)性比較分析。因此,本研究對此進(jìn)行了比較研究。不僅對不同轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了比較,而且在每種方法對細(xì)胞的損傷程度上也進(jìn)行了比較。通過對 3種轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率的比較,結(jié)果表明:玻璃珠法轉(zhuǎn)化效率最高,達(dá)到59%;而基因槍法和電擊法的轉(zhuǎn)化效率很低,分別僅有0.01%和2%。該 3種轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率的高低在其他不同藻類研究中存在相似性[11]。而 3種轉(zhuǎn)化方法對細(xì)胞的損傷程度比較結(jié)果顯示:基因槍法的損傷程度最為嚴(yán)重,轉(zhuǎn)化后僅有 26%的細(xì)胞存活,其原因是由于受高壓氣體的直接沖擊,造成多數(shù)細(xì)胞的破碎,使得細(xì)胞存活數(shù)目急劇下降,這也是該方法轉(zhuǎn)化效率低下的重要原因所在。玻璃珠法對細(xì)胞的損傷程度最輕,轉(zhuǎn)化后約有 90%的細(xì)胞存活,這也是決定其高轉(zhuǎn)化效率的重要基礎(chǔ)。電擊法對細(xì)胞的損傷程度介于二者方法之間,約有 58%的細(xì)胞存活,也客觀反映了電擊法轉(zhuǎn)化效率高于基因槍法的原因。由此可見,轉(zhuǎn)化方法對細(xì)胞的損傷程度直接影響著轉(zhuǎn)化效率的高低。

此外,本文還進(jìn)行了影響鹽藻玻璃珠法轉(zhuǎn)化結(jié)果的其他因素探討。在鹽藻玻璃珠轉(zhuǎn)化法整個操作過程的把握、轉(zhuǎn)化試劑的選擇和使用、鹽藻自身的狀態(tài)等方面都給出了注意事項和把握要點,力求最大程度上提高轉(zhuǎn)化效率。同時,在鹽藻的轉(zhuǎn)化過程中,盡可能減少不必要的操作步驟,盡可能的縮短對細(xì)胞的操作時間,對鹽藻的轉(zhuǎn)化也較為有利。

綜上所述,通過對鹽藻 3種不同轉(zhuǎn)化方法的比較,玻璃珠法不僅具有較佳的轉(zhuǎn)化效率、對宿主細(xì)胞的損傷作用小,而且還具有較高的經(jīng)濟(jì)性、重復(fù)性和可控性好等優(yōu)點,最為適合鹽藻細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化研究。同時,針對此 3種方法從不同方面又進(jìn)行了各自優(yōu)缺點的分析(見表1),希望為今后鹽藻的轉(zhuǎn)化工作提供參考。鹽藻玻璃珠轉(zhuǎn)化法的確立為加快鹽藻生物反應(yīng)器的研究步伐,及早實現(xiàn)外源物質(zhì)在該反應(yīng)器中的表達(dá)起到了積極推動作用。

表1 鹽藻不同轉(zhuǎn)化方法優(yōu)缺點的比較

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