魏寶東，齊 欣*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

產(chǎn)輔酶Q10白地霉菌的罐發(fā)酵條件優(yōu)化

魏寶東，齊 欣*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

以白地霉菌(Geotrichum candidum)為出發(fā)菌株，根據(jù)搖瓶發(fā)酵結(jié)果控制pH值進(jìn)行罐發(fā)酵。采用間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法，考察溶氧量、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣流量及補(bǔ)糖因素對菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量的影響。確定發(fā)酵罐發(fā)酵的最適條件為控制溶氧在35%～40%，補(bǔ)糖控制在發(fā)酵液糖質(zhì)量濃度為2g/L，該發(fā)酵條件下輔酶Q10產(chǎn)量從分批發(fā)酵的78.75mg/L提高到106.26mg/L，較搖瓶發(fā)酵提高了69.8%。

輔酶Q10；發(fā)酵罐；發(fā)酵條件

輔酶Q10(CoQ10)又名泛醌、癸烯醌，化學(xué)名稱為2,3-二甲基-5-甲基-6-癸異戊烯苯醌[1-2]。它與線粒體內(nèi)膜相結(jié)合，是呼吸鏈中重要的遞氫體。它是細(xì)胞自身產(chǎn)生的天然抗氧化劑、細(xì)胞代謝的激活劑[3]。輔酶Q10也具有重要的生理作用，廣泛應(yīng)用于食品添加劑、功能食品、保健品、化妝品及減肥食品等領(lǐng)域[4-6]。目前，輔酶Q10的制備方法中微生物發(fā)酵法應(yīng)用最廣泛[7-8]，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)具有原料成本低[9]、反應(yīng)條件溫和及可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等許多優(yōu)點(diǎn)，是一種非常經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方法。近幾年來，國內(nèi)關(guān)于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10的研究也取得了部分進(jìn)展，其中以鄒祥[10]、李俊峰等[11]應(yīng)用根瘤菌發(fā)酵和農(nóng)桿菌發(fā)酵最為常見。

搖瓶發(fā)酵適用于實(shí)驗(yàn)室，從搖瓶到發(fā)酵罐上的放大是發(fā)酵產(chǎn)品開發(fā)中一個非常重要的環(huán)節(jié)[12]。由于搖瓶發(fā)酵的條件與發(fā)酵罐的發(fā)酵條件在一定程度上存在差異，往往存在著“放大效應(yīng)”[13]，所以需在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上對發(fā)酵罐的發(fā)酵條件做進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)選用白地霉菌(Geotrichum candidum)為出發(fā)菌株生產(chǎn)輔酶Q10，在前期搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)研究[14-15]。

1 材料與方法

1.1 菌種

白地霉菌(Geotrichum candidum)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖4、蛋白胨0.3、酵母浸粉0.15、牛肉浸膏0.15、K2HPO40.05、瓊脂1.8、蒸餾水1L，pH6.0；種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3、蛋白胨0.3、K2HPO40.05、蒸餾水1L，pH6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖4、蛋白胨0.3、酵母浸粉0.15、牛肉浸膏0.15、K2HPO40.05、蒸餾水1L，pH6.0。

1.3 儀器與設(shè)備

BGZ-7智能型機(jī)械攪拌發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；ZWD-0.05/7全無油空氣壓縮機(jī) 寧波鄞州展翅全無油空壓機(jī)有限公司；TH-3560型全自控蒸汽滅菌鍋 上海奉賢協(xié)新機(jī)電廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.4 方法

1.4.1 適宜pH值的確定

控制適當(dāng)?shù)膒H值對發(fā)酵過程是非常重要的。在搖瓶發(fā)酵過程中，采用250mL三角瓶，固定轉(zhuǎn)速為200r/min，分別測定pH4、5、6、7、8、9時菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量，以確定適宜的初始pH值。

1.4.2 7L自動罐分批發(fā)酵參數(shù)的設(shè)定

發(fā)酵罐中各過程參數(shù)設(shè)定：培養(yǎng)溫度：29℃，罐壓：0.01MPa，7L發(fā)酵罐裝液量：5L，接種量：4g/L，發(fā)酵72h，隨需要調(diào)整通氣量，采用聚醚類消泡劑。根據(jù)搖瓶發(fā)酵pH值的研究結(jié)果，7L自動罐采用流加2mol/L的NaOH溶液來控制pH值，使pH值控制在易于輔酶Q10生成的范圍內(nèi)，直至發(fā)酵結(jié)束。

確定發(fā)酵過程的最適溶氧量，通過攪拌轉(zhuǎn)速及空氣流量兩方面共同控制溶氧量，菌體進(jìn)入生長對數(shù)期時耗氧量增大，罐內(nèi)溶氧量下降，此時增加攪拌轉(zhuǎn)速；當(dāng)菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，輔酶Q10也開始大量產(chǎn)生時，降低攪拌轉(zhuǎn)速，適時調(diào)節(jié)空氣流量，使溶氧維持在35%～40%。

1.4.3 7L自動罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵

1.4.3.1 發(fā)酵液中葡萄糖適宜質(zhì)量濃度的確定

發(fā)酵液葡萄糖初始質(zhì)量濃度為4g/L，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度分別下降至3、2.5、2、1.5g/L時，平均每3h補(bǔ)糖一次，使葡萄糖質(zhì)量濃度分別維持在3、2.5、2、1.5g/L，以確定能夠獲得最高輔酶Q10產(chǎn)量的發(fā)酵液葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.4.3.2 補(bǔ)糖種類及方式

根據(jù)葡萄糖適宜質(zhì)量濃度確定的結(jié)果，在葡萄糖質(zhì)量濃度下降到2g/L以下時，開始補(bǔ)加碳源為50%的葡萄糖，維持葡萄糖的質(zhì)量濃度在2.0g/L，以促進(jìn)菌體及輔酶Q10的大量合成。

1.4.4 輔酶Q10提取方法

參照文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始pH值對菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量的影響

由圖1可知，隨著pH值升高菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢，在pH值為6時菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為37.25g/L、62.47mg/L，因此確定最佳初始pH值為6。在采用自動發(fā)酵罐發(fā)酵時，通過流加2mol/L的NaOH溶液來調(diào)節(jié)pH值。

圖1 初始pH值對菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of initial pH on cell biomass and the yield of coenzyme Q10

2.2 7L自動罐分批發(fā)酵工藝參數(shù)的確定

2.2.1 溶氧量對輔酶Q10產(chǎn)量的影響

圖2 不同溶氧量對輔酶Q10產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of dissolved oxygen on the yield of coenzyme Q10

研究不同溶氧量對輔酶Q10產(chǎn)量的影響，從而更好的控制攪拌轉(zhuǎn)速及空氣流量。由圖2可知，當(dāng)溶氧控制在35%～40%時，輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)到最大值，為62.77mg/L。因此將溶氧控制在35%～40%范圍之內(nèi)。

2.2.2 攪拌轉(zhuǎn)速對菌體生物量和輔酶Q10產(chǎn)量的影響

圖3 攪拌轉(zhuǎn)速對菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of stirring speed on cell biomass and yield of coenzyme Q10

在控制溶氧35%～40%，空氣流速5L/min相對固定的條件下，研究全自動罐攪拌轉(zhuǎn)速對菌體生物量和輔酶Q10產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。在18～36h菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，由于好氧攪拌轉(zhuǎn)速從100r/min增加到600r/min，在此期間菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量都呈上升趨勢，在36h之后，隨著菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，攪拌轉(zhuǎn)速也應(yīng)逐漸減慢，輔酶Q10產(chǎn)量有所提高。

2.2.3 空氣流量對菌體生物量和輔酶Q10產(chǎn)量的影響

圖4 空氣流量對菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of airflow rate on cell biomass and the yield of coenzyme Q10

在控制溶氧35%～40%，攪拌轉(zhuǎn)速350r/min相對固定的條件下，研究全自動罐空氣流量對菌體生物量和輔酶Q10產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。在18～36h菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，由于好氧不斷提高空氣流量，最大值為8L/min，在此期間菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量都呈上升趨勢，36h之后，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，從而減少空氣流量，輔酶Q10產(chǎn)量有所提高。

2.2.4 攪拌轉(zhuǎn)速及空氣流量對菌體生物量、輔酶Q10產(chǎn)量及葡萄糖質(zhì)量濃度的綜合影響

圖5 攪拌轉(zhuǎn)速及空氣流量對菌體生物量、輔酶Q10產(chǎn)量及葡萄糖質(zhì)量濃度的綜合影響Fig.5 Combined effect of stirring speed and airflow rate on cell biomass and the yield of coenzyme Q10

從攪拌轉(zhuǎn)速及空氣流量兩方面同時控制溶氧在35%～40%，攪拌轉(zhuǎn)速不超過400r/min，空氣流量隨時調(diào)整(不超過于8L/min)，結(jié)果見圖5。菌種在對數(shù)生長期空氣流量最高達(dá)6L/min時可滿足菌種生長需要，進(jìn)入穩(wěn)定期后攪拌轉(zhuǎn)速及空氣流量分別下降到350r/min和4L/min，結(jié)果較搖瓶發(fā)酵輔酶Q10的產(chǎn)量有所提高。

2.2.5 消泡劑對菌體生物量及輔助Q10產(chǎn)量的影響

發(fā)酵過程中通氣攪拌和代謝所產(chǎn)生的氣體是泡沫產(chǎn)生的原因。泡沫的控制方法可分為機(jī)械消泡和化學(xué)消泡劑兩大類。常用的消泡劑分為天然油脂、聚醚類、高級醇類和硅樹脂類，這些物質(zhì)可作為碳源，但其消泡能力不強(qiáng)，應(yīng)用較多的是聚醚類。本研究在搖瓶條件下進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖6。針對該菌種聚醚類消泡劑性能穩(wěn)定，對菌體和輔酶Q10產(chǎn)量均無影響。因此，7L自動罐發(fā)酵采用聚醚類消泡劑，自動罐可通過泡沫液位檢測電極自動控制消泡劑的添加，維持發(fā)酵的正常進(jìn)行。

圖6 搖瓶發(fā)酵聚醚類消泡劑對菌體生物量和輔酶Q10產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of polyether defoamer on cell biomass and the yield of coenzyme Q10 during shake flask fermentation

2.3 7L自動罐分批發(fā)酵曲線

圖7 7L自動發(fā)酵罐分批發(fā)酵曲線Fig.7 Time courses of batch fermentation in a 7 L automatic fermenter

在控制發(fā)酵過程各參數(shù)(溶氧量、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、pH值)的前提下，進(jìn)行7L自動罐分批發(fā)酵試驗(yàn)，做出發(fā)酵曲線，結(jié)果如圖7所示。菌種在對數(shù)生長期，由于迅速生長對營養(yǎng)物質(zhì)的需要，發(fā)酵液中的碳源迅速下降，同時也伴隨著輔酶Q10的大量產(chǎn)生，當(dāng)碳源含量不高時，菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量也不再增加，在分批發(fā)酵中，菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量分別為44.34g/L、78.75mg/L。

2.4 7L自動罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵

2.4.1 發(fā)酵液中適宜葡萄糖質(zhì)量濃度的確定

由表1可知，由于發(fā)酵液中初始葡萄糖質(zhì)量濃度為4g/L，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度降至3g/L和2.5g/L時開始補(bǔ)糖，此時發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度過高，影響菌體及輔酶Q10的產(chǎn)生；維持1.5g/L的葡萄糖質(zhì)量濃度不能滿足菌體及輔酶Q10產(chǎn)生的需要；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度維持在2g/L時補(bǔ)糖，菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量最大，因此確定發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度為2g/L最適宜。

表1 發(fā)酵液中葡萄糖適宜質(zhì)量濃度的選擇Table 1 Effects of starting time and amount of glucose addition on cell biomass and the yield of coenzyme Q10

2.4.2 補(bǔ)糖指標(biāo)的確定

以葡萄糖質(zhì)量濃度作為發(fā)酵液的補(bǔ)糖指標(biāo)，發(fā)酵液中初始葡萄糖質(zhì)量濃度為4g/L，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度降至2g/L，發(fā)酵時間為30h時開始補(bǔ)糖，平均每隔3h補(bǔ)糖一次，通過控制葡萄糖的流加量維持發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度在2g/L，使菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量大幅度提高，在48h時停止補(bǔ)糖后，菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量都有所下降，在整個發(fā)酵過程中，葡萄糖總流加量為40g/L。

2.4.3 7L自動罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵曲線

圖8 7L自動發(fā)酵罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵曲線Fig.8 Time courses of intermittent fed-batch fermentation in a 7 L automatic fermenter

在控制發(fā)酵過程各參數(shù)的前提下，進(jìn)行7L自動罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，做出發(fā)酵曲線。結(jié)果如圖8所示，通過間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中添加葡萄糖，使菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量的最大值較分批發(fā)酵時滯后6h，但產(chǎn)量有所提高，菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量分別為58.56g/L、106.26mg/L。

3 結(jié) 論

研究7L自動罐分批發(fā)酵中的各個參數(shù)，通過攪拌轉(zhuǎn)速及空氣流量兩方面共同控制溶氧量，使溶氧維持在35%～40%，通氣量隨需要隨時進(jìn)行調(diào)節(jié)，發(fā)酵過程中加入聚醚類做為消泡劑，通過添加堿液控制發(fā)酵過程的pH值在適宜的范圍內(nèi)，確定了7L自動罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵的參數(shù)，葡萄糖的流加量控制在維持發(fā)酵液葡萄糖質(zhì)量濃度為2g/L，以獲得更高的菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量。7L自動發(fā)酵罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵輔酶Q10產(chǎn)量為106.26mg/L，較搖瓶發(fā)酵提高了69.8%。

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Optimization of Tank Fermentation Conditions for Coenzyme Q10Production by White Geotrichum candidum

WEI Bao-dong，QI Xin*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

For the production of Coenzyme Q10, Geotrichum candidum was intermittent fed-batch cultured in a stirred tank fermenter, and pH was controlled according to the results of previous studies on shake flask fermentation during the process. The effects of dissolved oxygen, stirring speed, airflow rate, and sugar amount on biomass and coenzyme Q10production were investigated. The optimal fermentation conditions were determined as follows: dissolved oxygen, 35%-40% and sugar concentration, 2 g/L. Under these optimal conditions, the yield of coenzyme Q10 from batch fermentation was increased from 78.75 to 106.26 mg/L, which exhibited an improvement by 69.8% as compared to shake flask fermentation.

coenzyme Q10；fermenter；fermentation conditions

TS201.3

A

1002-6630(2011)07-0247-04

2010-08-09

魏寶東(1969—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称分圃炫c保藏。E-mail：bdwei2003@yahoo.com

*通信作者：齊欣(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：qixin771015@163.com