陸艷艷，邱細(xì)敏*，劉湘軍，朱劍波，馮 星，張 瑜

(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖南 長沙 410006)

人工蟲草多糖對小鼠CCl4肝損傷的保護(hù)作用

陸艷艷，邱細(xì)敏*，劉湘軍，朱劍波，馮 星，張 瑜

(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖南 長沙 410006)

目的：研究人工蟲草不同部位多糖及固體培養(yǎng)殘基多糖對小鼠CCl4肝損傷的保護(hù)作用。方法：取健康的雄性小鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分成6組：正常對照組、急性CCl4肝損傷模型組、蟲草子實(shí)體多糖組、菌絲體多糖組、固體培養(yǎng)殘基多糖組和陽性藥物組，每組10只。用紫外分光光度法測定比較血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量，測定肝組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總蛋白(TP)含量，并對肝細(xì)胞的組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。結(jié)果：蟲草多糖子實(shí)體、菌絲體和固體培養(yǎng)殘基多糖組，能顯著抑制CCl4引起的小鼠血清ALT、AST活性及肝臟MDA含量的升高，以及肝臟SOD含量的降低，并能顯著減輕CCl4引起的肝小葉內(nèi)的灶性壞死。結(jié)論：蟲草多糖子實(shí)體、菌絲體和固體培養(yǎng)殘基多糖組對小鼠化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用，人工蟲草子實(shí)體多糖效果最優(yōu)，其次為菌絲體多糖，再次為固體培養(yǎng)殘基多糖。

人工冬蟲夏草；子實(shí)體；菌絲體；固體培養(yǎng)殘基；多糖；肝損傷

肝損傷是嚴(yán)重威脅人類健康的世界性疾病。肝損傷分為化學(xué)性肝損傷和病理性肝損傷?；瘜W(xué)性肝損傷主要是由于過敏、化學(xué)藥物中毒等引起，比如酒精、藥物、有機(jī)農(nóng)藥中毒等都會引起肝損傷、肝功能異常。據(jù)了解，目前有上千種西藥會造成肝損傷。肝病在我國具有較高的發(fā)病率，且發(fā)病年齡偏低，起病隱襲，病程遷延，常發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化，并發(fā)肝性腦病、上消化道出血、頑固性腹水，反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重危害到病人的生命安全。肝損傷是慢性肝炎向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)途徑，具有可逆轉(zhuǎn)、持續(xù)時間長的特點(diǎn)。如果能得到有效治療，則可延緩或防止肝病的發(fā)展。因而肝損傷防治具有極其重要的臨床意義。我國傳統(tǒng)的中醫(yī)藥在肝病的防治領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢。已有一些中藥被臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)具有抗損傷的作用，其中蟲草是受到廣泛關(guān)注的一種，但其確切的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究復(fù)制小鼠CCl4肝損傷模型，并給予蟲草多糖干預(yù)，以觀察其對這一病變過程的阻斷作用。為預(yù)防或延緩肝病的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級小鼠：雄性，體質(zhì)量(20±2)g，SCXK(湘2006-0001)，由湖南長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動物科技服務(wù)部提供。

人工冬蟲夏草(2005年產(chǎn)品通過ISO9001：2000質(zhì)量管理體系認(rèn)證；獲得美國FDA認(rèn)證，證書號2121209)湖南益康高科技生物有限公司；護(hù)肝片 黑龍江葵花藥業(yè)集團(tuán)醫(yī)藥有限公司；冰醋酸、四氯化碳、甲醛 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇 長沙湘科精細(xì)化工廠；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2501紫外分光光度計(jì)、AUY 120電子分析天平日本島津公司；5451C離心機(jī) 德國Eppendorf公司；冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蟲草多糖提取

分別取人工冬蟲夏草干品的子實(shí)體、菌絲體及固體培養(yǎng)殘基適量，粉碎稱質(zhì)量，加無水乙醚于圓底燒瓶中，連續(xù)回流脫脂，過濾風(fēng)干后的藥渣用8倍量沸水回流提取3次，分別以10、6、6倍體積的沸水，各提取2、1、1h，合并上清液[1]，經(jīng)濃縮后，75%乙醇溶液沉淀、Sevag法脫蛋白、蒸餾水透析72h，無水乙醇洗滌3次后，經(jīng)冷凍干燥后得蟲草精多糖。臨用時分別配制成50mg/mL蟲草子實(shí)體、菌絲體、固體培養(yǎng)殘基多糖-生理鹽水溶液[2]。

1.3.2 動物分組及給藥

將清潔級小鼠 60只，隨機(jī)分為6組：正常對照組(飼喂正常飼料)、急性CCl4肝損傷模型組(簡稱模型對照組，正常飼料＋CCl4)、蟲草子實(shí)體多糖組(正常飼料＋CCl4＋500mg/kg多糖)、蟲草菌絲體多糖組(正常飼料＋CCl4＋500mg/kg多糖)、蟲草固體培養(yǎng)殘基多糖組(正常飼料+CCl4＋500mg/kg多糖)和陽性藥物組(護(hù)肝片溶液100mg/kg)，每組各10只[3]。每天晚上7:00，蟲草子實(shí)體多糖組、菌絲體多糖組、固體培養(yǎng)殘基多糖組分別以相應(yīng)多糖溶液灌胃0.2mL，陽性藥物組以10mg/mL護(hù)肝片-生理鹽水溶液灌胃0.2mL，正常對照組與模型對照組灌胃等體積0.2mL生理鹽水，連續(xù)灌胃7d，末次灌胃2h后，正常對照組注射0.2mL花生油，其他各組每只鼠腹腔注射0.2% CCl4花生油溶液0.2mL[4-5]。

1.3.3 樣品采集

末次給藥后，禁食16h，斷頭取血約3mL，室溫放置2h，3000r/min離心10min后取血清，-20℃密封保存?zhèn)溆?；取肝左葉用生理鹽水制成10%的組織勻漿。取肝右葉，用10%甲醛溶液固定，冰凍保存。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 血清指標(biāo)測定

嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書，采用賴氏法測定AST與ALT活力[6]。

1.4.2 肝勻漿中MDA指標(biāo)測定

按照試劑盒操作說明書，采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量[7]。

1.4.3 肝臟SOD和TP測定

按照試劑盒操作說明書，取肝勻漿，用考馬斯亮藍(lán)法測定組織中蛋白含量，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性[8-10]。

1.4.4 肝組織病理變化

取甲醛固定的肝右葉組織，常規(guī)石蠟切片，HE染色、20×10倍光鏡鏡檢[11-13]。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用方差分析和t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)都以x±s表示。實(shí)驗(yàn)過程中60只大鼠，模型對照組死亡1只，其余各組均為10只。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工蟲草多糖對小鼠血清ALT和AST的影響

表1 蟲草多糖對CCl4肝損傷小鼠血清ALT和AST活性影響Table 1 Effect of polysaccharides from different parts of Cordyceps sinensis on the activities of serum ALT and AST in mice with CCl4-induced liver damage

由表1可知，模型對照組的AST、ALT水平顯著高于正常對照組(P＜0.01)，說明肝細(xì)胞已受到破壞。陽性藥物組和不同部位多糖中AST、ALT水平顯著低于模型對照組(P＜0.01)，表明治療組起到了抑制AST、ALT升高的作用[14]。子實(shí)體、菌絲體、固體培養(yǎng)殘基多糖組同陽性藥物組比較有顯著性差異(P＞0.05)，說明人工蟲草不同部位多糖同陽性藥物組都對肝細(xì)胞損傷療效相當(dāng)，且子實(shí)體多糖療效高于護(hù)肝藥。各多糖治療組間比較，子實(shí)體多糖療效略高于菌絲體多糖，二者效果均高于固體培養(yǎng)殘基多糖。

2.2 人工蟲草多糖對小鼠肝勻漿SOD活性、TP及MDA含量的影響

表2 蟲草多糖對CCl4肝損傷小鼠肝勻漿SOD活性、MDA和TP含量的影響Table 2 Effect of polysaccharides from different parts of Cordyceps sinensis on SOD activity as well as MDA and TP contents in liver of mice with CCl4-induced liver damage

由表2可見，模型對照組SOD水平顯著低于正常對照組(P＜0.01)，說明肝細(xì)胞已受到破壞。陽性藥物組、菌絲體、子實(shí)體和固體培養(yǎng)殘基多糖組SOD水平顯著高于模型對照組(P＜0.01)，表明陽性藥物與蟲草多糖治療組起到了抑制SOD降低的作用。各治療組總蛋白與模型對照組比較，無明顯差異(P＞0.05)，推測可能因造模時間太短，總蛋白的變化沒有充分表現(xiàn)出來。

模型對照組MDA含量顯著高于正常對照組(P＜0.01)，說明CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型成功。陽性藥物組、菌絲體、子實(shí)體和固體培養(yǎng)殘基多糖組MDA水平顯著低于模型對照組(P＜0.01)，表明陽性藥物與蟲草多糖治療組起到了抑制MDA升高的作用。

2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察

制作肝臟病理切片，進(jìn)行光鏡觀察，見圖1。正常對照組：細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰。模型對照組：肝細(xì)胞索紊亂，肝細(xì)胞廣泛壞死，壞死灶分布于肝小葉中央靜脈周圍和肝被膜下，肝細(xì)胞變性，周圍有空泡，脂肪性變嚴(yán)重，大量炎癥細(xì)胞浸潤。與血清AST、ALT升高結(jié)果一致。蟲草子實(shí)體多糖組：肝細(xì)胞損傷明顯減輕，肝細(xì)胞呈不同程度脂肪變性、水腫，壞死灶不明顯。蟲草菌絲體多糖組：肝小葉中央靜脈周圍有少量肝細(xì)胞輕度壞死，壞死灶明顯減少，偶見散在點(diǎn)狀分布，水腫不明顯。蟲草固體培養(yǎng)殘基多糖組：可見肝細(xì)胞中度及重度脂肪變性，以小葉中心較為明顯，可見點(diǎn)、灶性壞死。陽性藥物組：肝細(xì)胞輕度脂變，少量炎細(xì)胞侵潤，呈點(diǎn)狀壞死，水腫不明顯?？梢娤x草子實(shí)體、菌絲體和固體培養(yǎng)殘基多糖組對CCl4肝損傷小鼠肝細(xì)胞的壞死均具有顯著的保護(hù)作用，但3組之間區(qū)別不大，未見明顯差異。

圖1 各組肝細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)觀察(HE染色，20×10)Fig.1 Morphology of liver cells from normal group, model group with CCl4-induced liver damage, fruitbody polysaccharide group, mycelium polysaccharide group, solid culture residue polysaccharide group, positive control group (HE, 20×10)

3 討 論

CCl4是一種常用的化學(xué)性肝損傷誘導(dǎo)劑，進(jìn)入體內(nèi)后，被肝臟中的微粒體細(xì)胞色素氧化酶(P-450)激活產(chǎn)生活潑的三氯甲基，該自由基易與肝細(xì)胞微粒體、溶酶體、內(nèi)織網(wǎng)的脂蛋白膜結(jié)合產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致小鼠ALT、AST、MDA水平升高，SOD水平降低[15]。小鼠CCl4肝損傷模型易于操作、耗時短、費(fèi)用低廉，因此選定此模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

ALT和AST是反映線粒體膜損傷和肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。正常情況下血清ALT活性很低，當(dāng)肝細(xì)胞受損時，其細(xì)胞膜通透性增大，促進(jìn)ALT的釋放；AST主要分布在線粒體內(nèi)，當(dāng)線粒體膜受損時，血清中的AST含量會升高[16]。人工蟲草不同部位多糖可降低血清ALT、AST的含量，與模型組比較有顯著差異，說明蟲草多糖對肝細(xì)胞和線粒體膜有保護(hù)作用，且子實(shí)體多糖療效高于菌絲體，固體培養(yǎng)殘基多糖次之。

MDA含量變化可反映肝細(xì)胞損傷程度[17]，SOD是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶。蟲草多糖通過抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物MDA的含量降低，增強(qiáng)SOD的活性，促使肝細(xì)胞的抗氧化能力增強(qiáng)，從而抵御肝細(xì)胞過氧化和氧應(yīng)激，使肝細(xì)胞避免受損，達(dá)到治療肝損傷的目的。當(dāng)肝細(xì)胞受損時，蛋白合成會受阻，但本實(shí)驗(yàn)蛋白受阻現(xiàn)象不明顯，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

目前人工冬蟲夏草藥用部位主要采用子實(shí)體，本實(shí)驗(yàn)針對工業(yè)生產(chǎn)中的副產(chǎn)物菌絲體未能充分利用，固體培養(yǎng)殘基更是作為廢料處理的浪費(fèi)現(xiàn)象(約97%的固體培養(yǎng)殘基，直接排放掉，不僅造成環(huán)境污染，而且浪費(fèi)蟲草資源)，以人工冬蟲夏草為樣本，通過文獻(xiàn)[17-18]和實(shí)驗(yàn)確證不同部位蟲草多糖的含量和結(jié)構(gòu)存在差別，本實(shí)驗(yàn)通過研究不同部位蟲草多糖對小鼠肝損傷的保護(hù)作用，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用人工冬蟲夏草資源提供有價值的參考。

綜上所述：蟲草多糖子實(shí)體、菌絲體和固體培養(yǎng)殘基多糖組，能顯著抑制CCl4引起的小鼠血清ALT、AST活性及肝臟MDA含量的升高，以及肝臟SOD含量的降低，并能顯著減輕CCl4引起的肝小葉內(nèi)的灶性壞死，對肝損傷產(chǎn)生顯著保護(hù)作用。人工蟲草固體培養(yǎng)殘基、菌絲體多糖與陽性藥物療效差異不大，且略低于子實(shí)體多糖的療效，因此從本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)出人工蟲草固體培養(yǎng)殘基和菌絲體在藥理方面有被利用的價值。

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Protective Effect of Polysaccharides from Different Parts of Cultured Cordyceps sinensis on CCl4-induced Liver Damage in Mice

LU Yan-yan，QIU Xi-min*，LIU Xiang-jun，ZHU Jian-bo，F(xiàn)ENG Xing，ZHANG Yu
(Department of Pharmacy, Medical College of Hunan Normal University, Changsha 410006, China)

Objective: To explore the protective function of polysaccharides from different parts (fruitbodies, mycelia and residual solid medium) of cultured Cordyceps sinensis on carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver damage in mice. Methods: Totally 60 healthy male mice with the body weight of (20 ± 2) g were randomly divided into 6 groups: control group, acute CCl4hepatic injury model group, sporophore polysaccharide group, mycelium polysaccharide group, solid culture residue polysaccharide group and positive control group with 10 mice in each group. The activities of serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and total protein (TP) were determined. The morphology of liver tissues was examined. Results: An obvious inhibition effect of polysaccharides from fruitbodies, mycelia and residual solid medium of Cordyceps sinensis on the increases of AST and ALT activities in serum and MDA in liver was observed. In contrast, the polysaccharides from the three sources could decrease SOD activity in liver and ameliorate local necrosis in liver. Conclusion: The three polysaccharides from Cordyceps sinensis have an obvious protective effect against chemical-induced liver damage. Fruitbody polysaccharides are superior to mycelium polysaccharides.

cultured Cordyceps sinensis；solid culture residue；mycelium；fruitbody；polysaccharide；liver injury

TS218

A

1002-6630(2011)07-0319-04

2010-09-02

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(10A071)；國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(043-0094)

陸艷艷(1985—)，女，碩士研究生，主要從事中草藥分離分析研究。E-mail：weixiaopast99@126.com

*通信作者：邱細(xì)敏(1954—)，女，教授，本科，主要從事中藥材分離分析研究。E-mail：qiuximin@tom.com