李 貞，高麗萍*，冷洪濤，張海蓮

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100083)

葡萄籽原花青素對順鉑所致人胚腎細(xì)胞毒性的拮抗作用

李 貞，高麗萍*，冷洪濤，張海蓮

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100083)

目的：體外研究葡萄籽原花青素提取物(GSPE)對順鉑(CDDP)所致人胚腎細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)理。方法：體外培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞(HEK293)，四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)法觀察葡萄籽原花青素、CDDP對HEK293細(xì)胞生長的影響及葡萄籽原花青素對CDDP所致細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，硫代巴比妥酸法觀察葡萄籽原花青素對CDDP引起脂質(zhì)過氧化的影響，利用二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應(yīng)，比色定量測定吸光度以觀察葡萄籽原花青素對CDDP誘導(dǎo)的谷胱甘肽耗竭的影響。結(jié)果：低濃度的GSPE可顯著增強(qiáng)HEK293的細(xì)胞活性，適宜濃度的GSPE可顯著抑制CDDP對HEK293細(xì)胞的毒性作用，GSPE可減緩CDDP引起的谷胱甘肽的耗竭。結(jié)論：GSPE能抑制CDDP誘發(fā)HEK293細(xì)胞的細(xì)胞毒性，其機(jī)理可能與GSPE強(qiáng)抗氧化功能和猝滅自由基的功能有關(guān)。

順鉑；葡萄籽原花青素提取物；腎毒性；HEK293；氧化應(yīng)激

順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)是臨床上廣泛使用的化療藥物，普遍用于各種實體瘤的治療，但是CDDP的腎毒性明顯，且限制了其臨床使用。目前，CDDP所致的腎毒性機(jī)制尚不十分清楚。研究表明，CDDP在機(jī)體中破壞氧自由基代謝的平衡狀態(tài)，從而引發(fā)氧化應(yīng)激[1]。原花青素屬黃酮類物質(zhì)，在植物性食品中廣泛存在，其具有極強(qiáng)的抗氧化能力，還可以降低血壓、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)心腦血管，此外原花青素還有抗心肌缺血再灌注損傷、抗動脈粥樣硬化、抗脂質(zhì)過氧化、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、抗突變等功能[2-7]。因此本研究采用人胚腎細(xì)胞293(HEK293)細(xì)胞體外觀察葡萄籽原花青素提取物(grape seed proanthocyanidinextract，GSPE)對CDDP腎毒性的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HEK293細(xì)胞由北京師范大學(xué)提供 。

順鉑(注射用粉劑，批號906015CF，臨用前用生理鹽水配制) 齊魯制藥廠；葡萄籽原花青素提取物(純度大于95%，蒸餾水溶解后過濾除菌避光保存，用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋到所需濃度) 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；新生牛血清及DMEM培養(yǎng)液 美國Gibco公司；四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT) 美國Sigma公司；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)基為含雙抗(100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素)及10%新生牛血清的DMED(含丙酮酸鈉)，于37℃、含5%CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.3 細(xì)胞毒性實驗

采用MTT比色法[8]測定CDDP、GSPE對HEK293細(xì)胞毒性作用，及GSPE對CDDP所致細(xì)胞毒性的影響。

1.3.1 CDDP對HEK293的毒性作用

將100μL(1×105個/mL)HEK293細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，加入不同濃度的CDDP生理鹽水溶液(終濃度分別為0、0.016、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4mmol/L)，每組設(shè)6個復(fù)孔，在37℃、含5%CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.3.2 MTT法

按照1.3.1節(jié)對細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，培養(yǎng)至24h終末，向培養(yǎng)基中加入MTT，使終質(zhì)量濃度為0.5g/L，于37℃、含5% CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，棄上清并加入DMSO(100μL/孔)，混勻10min，用酶標(biāo)儀檢測(測定波長570nm，參比波長630nm)吸光度(A)，以CDDP添加濃度為0時作為空白對照組，細(xì)胞抑制率的計算方法為：

細(xì)胞抑制率/%=(1-A實驗組/A空白對照組)×100 (1)

1.3.3 GSPE對HEK293細(xì)胞生長的影響

細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.3.1節(jié)，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，加入不同濃度的GSPE(終質(zhì)量濃度分別為0、0.001、0.002、0.004、0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256、0.512、1.024、4.096、8.192、16.384、32.768g/L)，每組設(shè)6個復(fù)孔，在37℃、含5% CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，使用MTT法測定吸光度，觀察GSPE對HEK293細(xì)胞生長的影響。

1.3.4 GSPE對CDDP所致細(xì)胞毒性的保護(hù)作用

細(xì)胞消化、終止消化、計數(shù)、調(diào)整密度為(1×105個/mL)后，每孔100μL進(jìn)行鋪板，37℃、含5% CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合狀態(tài)，進(jìn)行實驗。細(xì)胞分組為：空白對照組：CDDP終濃度0mmol/L、GSPE終質(zhì)量濃度0g/L，使用含10%新生牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)(加藥時同時相應(yīng)加入與模型組、用藥組等體積的DMEM培養(yǎng)液和生理鹽水孵育)；模型組：以0.094mmol/L CDDP在37℃、含5% CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h方法造模；CDDP+GSPE組：加CDDP前30min加入不同質(zhì)量濃度的GSPE(終質(zhì)量濃度分別為：0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256、0.512、1.024g/L)。每組設(shè)8個復(fù)孔，采用MTT法測定吸光度，計算細(xì)胞抑制率變化，并以圖表示。

1.4 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH、蛋白含量的測定

按照參考文獻(xiàn)[9]將HEK293細(xì)胞(1×105個/mL)3mL接種到6孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，加入終質(zhì)量濃度為0.512g/L的GSPE培養(yǎng)液，30min后加入終濃度為0.094mmol/L的CDDP，37℃、含5% CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)，消化細(xì)胞并收集，PBS洗兩遍，離心棄上清，每孔細(xì)胞加入0.7mL生理鹽水，反復(fù)凍融3次，3000r/min離心15min，取上清為細(xì)胞勻漿，嚴(yán)格按照MDA含量、GSH含量和蛋白含量測定試劑盒所述方法測定。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。單因素方差分析判斷GSPE 對CDDP毒性的影響。多功能半數(shù)致死量軟件2.1版(Sun Yat-Sen University of Medical Sciences)Bliss法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDDP對HEK293細(xì)胞的毒性作用

圖1 CDDP對HEK293的毒性作用Fig.1 Toxic effect of CDDP on HEK293 cells

如圖1所示，MTT法測定CDDP對HEK293細(xì)胞的抑制作用。隨CDDP濃度升高，細(xì)胞抑制率增大，呈明顯的劑量依賴關(guān)系，24h的IC50值為(0.094±0.02)mmol/L。

2.2 GSPE對HEK293細(xì)胞存活率的影響

圖2 GSPE對HEK293存活率的影響Fig.2 Effect of GSPE on the viability of HEK293 cells

如圖2所示，MTT法測定GSPE對HEK293細(xì)胞存活率的影響。隨GSPE質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸增高，GSPE終質(zhì)量濃度為0.064g/L時，細(xì)胞存活率達(dá)到最高，以后隨著質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞存活率反而逐漸降低，GSPE終質(zhì)量濃度高于0.256g/L時，細(xì)胞存活率明顯低于空白對照組，即高質(zhì)量濃度GSPE對細(xì)胞具有毒性作用，抑制了細(xì)胞的生長。GSPE 24h的IC50值為(1.9165±0.04)g/L。

2.3 GSPE對CDDP所致細(xì)胞毒性的影響

圖3 GSPE對CDDP所致毒性的抑制作用Fig.3 Protective effect of GSPE against CDDP-induced neurotoxicity in HEK293 cells

如圖3所示，用終濃度0.094mmol/L的CDDP孵育HEK293 24h建立毒性模型，用不同終質(zhì)量濃度的GSPE拮抗細(xì)胞毒性，可見細(xì)胞存活率隨著GSPE質(zhì)量濃度升高而增高。其中終質(zhì)量濃度為0.256、0.512、1.024g/L的GSPE可顯著降低CDDP對HEK293細(xì)胞的抑制作用，提高細(xì)胞的存活率，且0.512g/L細(xì)胞存活率最高，提示適當(dāng)劑量的GSPE對CDDP所致細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用。

2.4 GSPE對CDDP所致細(xì)胞MDA、GSH含量的影響

如圖4、5所示，終濃度為0.094mmol/L的CDDP作用于HEK293細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量與空白對照組相比顯著升高、GSH含量顯著降低。終質(zhì)量濃度為0.512g/L的GSPE預(yù)處理30min后，再與0.094mmol/L的CDDP孵育24h，細(xì)胞內(nèi)MDA含量與模型組無顯著差異，GSH明顯升高，與模型組相比有顯著性差異。

圖4 GSPE對CDDP作用細(xì)胞MDA含量的影響Fig.4 Effect of GSPE on MDA content in CDDP-induced HEK 293 cells

圖5 GSPE對CDDP作用細(xì)胞GSH含量的影響Fig.5 Effect of GSPE on GSH content in CDDP-induced HEK 293 cells

3 討 論

CDDP進(jìn)入機(jī)體后主要經(jīng)腎臟排泄，其毒副作用也以腎臟毒性最為明顯，CDDP選擇性地作用于腎細(xì)胞使其受損。本研究以不同濃度CDDP加入HEK293細(xì)胞中培養(yǎng)造模，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)24h后各模型組吸光度與空白對照組相比較均有顯著性差異，提示只要持續(xù)作用，即使低濃度CDDP仍可引起腎細(xì)胞受損，因此應(yīng)引起臨床醫(yī)生的高度重視。

CDDP腎毒性的細(xì)胞毒機(jī)理仍不明，有證據(jù)顯示，CDDP引起腎功能損害的主要原因可能是與氧化應(yīng)激有關(guān)的氧化性損傷[10-11]。CDDP引起腎臟損傷的主要成分是其水解代謝產(chǎn)物，CDDP的親核基團(tuán)可與水分子作用產(chǎn)生大量的自由基，自由基與生物膜上不飽和脂肪酸反應(yīng)，引起膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致膜通透性和膜脂質(zhì)流動性的改變，同時產(chǎn)生多種有毒的降解產(chǎn)物。脂質(zhì)過氧化主要產(chǎn)物MDA既是其結(jié)果，又是繼發(fā)損害的毒性產(chǎn)物，其含量變化可反映體內(nèi)自由基代謝的異常及脂質(zhì)過氧化速率，因此MDA含量高低既反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，也間接反映受自由基攻擊致腎損害的嚴(yán)重程度。GSH是非蛋白巰基的一種，是細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化防御系統(tǒng)，腎臟對GSH的利用能力對細(xì)胞抵抗各種化學(xué)毒物損傷上起重要作用[12]。有資料表明，GSH及其前體物N-乙酰半胱氨酸(NAC)中的巰基可與CDDP結(jié)合；GSH可降低細(xì)胞內(nèi)鉑(Pt)含量；此外，GSH可顯著提高CDDP的細(xì)胞存活率，這些可能是GSH在CDDP所致腎毒性中起保護(hù)作用的原因[13]。本研究結(jié)果顯示，加入CDDP后，HEK293細(xì)胞MDA的含量明顯升高，GSH含量明顯降低，表明CDDP誘發(fā) HEK293細(xì)胞的損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。

花青素屬生物黃酮類，可從許多植物中提取得到，花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)上的酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)，從而能夠消耗環(huán)境中的氧，對自由基有很強(qiáng)的捕捉和消除能力，在體內(nèi)抗氧化消除自由基的能力很強(qiáng)，是一種很好的氧自由基清除劑。本研究結(jié)果顯示：在一定濃度范圍內(nèi)，隨著GSPE濃度的增加，HEK293細(xì)胞的存活率逐漸增加，并且適當(dāng)劑量的GSPE可顯著降低CDDP對HEK293細(xì)胞的抑制作用，抑制CDDP造成GSH含量的下降，提示適當(dāng)劑量的GSPE對CDDP毒性作用的細(xì)胞具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用的機(jī)制可能是GSPE抑制了CDDP引起的GSH耗竭，從而抑制了CDDP引起的細(xì)胞損傷，提高了細(xì)胞的生存率。

[1] SOMANI S M, RAVI R, RYBAK L P. Diethyldithioccarbamate protection against cisplatin nephrotoxicity: antioxidant system[J]. Drug Chem Toxicol, 1995, 18(2/3): 151-170.

[2] PATAKI T, BAK I, KOVACS P, et al. Grape seed proanthocyanidins improved cardiac recovery during reperfusion after ischemia in isolated rat hearts[J]. Am J Clin Nutr, 2002, 75(5): 894-905.

[3] 畢玲, 傅柏平. 葡萄籽原花青素提取物的研究進(jìn)展[J]. 中國新藥雜志, 2008, 17(17): 1478-1481.

[4] 郭金英, 李松彪, 劉開永, 等. 葡萄籽超微粉對高血脂金黃地鼠血漿NO、ET-1和C反應(yīng)蛋白的影響[J]. 營養(yǎng)衛(wèi)生, 2008, 29(9): 598-600.

[5] 郭金英, 李華, 袁春龍, 等. 葡萄籽超微粉對金黃地鼠血脂水平的影響[J]. 中國食品學(xué)報, 2007, 7(1): 48-53.

[6] 張琳, 買買提祖農(nóng)·買蘇爾, 袁一木, 等. 葡萄籽原花青素對大鼠肝缺血再灌注損傷的抗氧化作用研究[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2010, 33(2): 121-123.

[7] 李華, 李佩洪, 李勇, 等. 葡萄籽超微粉體外消化后抗氧化能力的檢測[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(10): 149-152.

[8] MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods, 1983, 65(1/2): 55-63.

[9] LEAL L K, NOBRE JUNIOR H V, CUNHA G M, et al. Amburoside A, a glucoside from Amburana cearensis, protects mesencephalic cells against 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity[J]. Neurosci Lett, 2005, 388(2): 86-90.

[10] 方允中. 自由基與酶[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1989: 229.

[11] CHIRINO Y I, PEDRAZA-CHAVERRI J. Role of oxidative and nitrosative stress in cisplatin-induced nephrotoxicity[J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2009, 61(3): 223-242.

[12] 楊敬華, 徐兆發(fā), 徐斌, 等. 鎘致大鼠腎臟毒性機(jī)制研究[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2007, 23(7): 887-888.

[13] 盧永科, 李昱辰, 杜伯雨, 等. 非蛋白巰基對順鉑在HEK293細(xì)胞內(nèi)積累量的影響[J]. 衛(wèi)生毒理學(xué)雜志, 2004, 18(3): 167-168.

Protective Effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract against Cisplatin-induced Nephrotoxicity in HEK293 Cell

LI Zhen，GAO Li-ping*，LENG Hong-tao，ZHANG Hai-lian
(Beijing Municipal Key Laboratory of Biologically Active Substances and Functional Food, College of Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100083, China)

Objective: To investigate the protective effect of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) against cisplatin (CDDP)-induced nephrotoxicity in human embryo kidney (HEK) 293 cells and its possible mechanisms. Methods: The effects of GSPE and CDDP on the in vitro growth of HEK 293 cells and the effect of GSPE on CDDP-induced nephrotoxicity were observed by MTT assay. TBARS assay was used to evaluate the effect of GSPE on GSPE-induced lipid peroxidation. The effect of GSPE on CDDP-induced glutathione depletion was examined by colorimetrically determining absorbance resulting from the reaction between DTNB and hydroxyl compounds. Low concentrations of GSPE could remarkably enhance the activity of HEK 293 cells. CDDP-induced nephrotoxicity in these cells was obviously inhibited by appropriate concentrations of GSPE. Additionally, GSPE could also alleviate CDDP-induced glutathione depletion. Conclusion: GSPE has the potential to inhibit CDDP-induced nephrotoxicity in HEK 293 cells, and the possible mechanism is associated with the strong antioxidant function and free radical quenching activity of GSPE.

cisplatin；GSPE；nephrotoxicity；HEK293；oxidative stress

Q946.8

A

1002-6630(2011)07-0315-04

2010-08-22

北京市教委面上項目(KM200911417004)

李貞(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為功能性食品生化作用。E-mail：babylizhen@163.com

*通信作者：高麗萍(1962—)，女，教授，博士，研究方向為功能性食品生化作用。E-mail：gaolip62@163.com