方正清，劉長安，汪遠(yuǎn)金，朱 潔，白 玫

(安徽中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥 230038)

大豆異黃酮對AD大鼠海馬PS-1表達(dá)的影響

方正清，劉長安，汪遠(yuǎn)金，朱 潔，白 玫

(安徽中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥 230038)

目的：探討大豆異黃酮(SIF)對AD大鼠海馬PS-1表達(dá)的影響。方法：采用β-淀粉樣蛋白(Aβ)單側(cè)海馬注射建立阿爾茨海默病(AD)大鼠模型，給予相應(yīng)藥物后，利用跳臺實(shí)驗(yàn)觀察AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，免疫組化檢測AD大鼠海馬早老素(PS-1)表達(dá)。結(jié)果：大豆異黃酮可改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(P＜0.01)，顯著性降低AD大鼠PS-1表達(dá)(P＜0.01)。結(jié)論：大豆異黃酮顯著降低AD大鼠海馬組織PS-1表達(dá)，從而改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

大豆異黃酮；阿爾茨海默病；β-淀粉樣蛋白；PS-1

大豆異黃酮(soybean isoflavones，SIF)來源于大豆的植物雌激素，是具有弱雌激素作用的雜環(huán)多酚類化合物，其主要成分是三羥異黃酮(genistein)、二羥異黃酮(daidzein)和甲氧基大豆素(glycitein)。其結(jié)構(gòu)與17β-雌二醇相似[1]，可與雌激素受體(ER)結(jié)合，表現(xiàn)弱的類雌激素樣作用。曾經(jīng)報(bào)道大豆異黃酮能改善骨質(zhì)疏松作用[2]。阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)的發(fā)病與早老素基因(presenilin，PS)的突變有關(guān)，早老素PS1和PS2的突變參與了AD的老年斑(senile plaque，SP)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)的形成。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Aβ25～35誘導(dǎo)制備AD模型，給予不同劑量的大豆異黃酮，觀察其對大鼠海馬組織PS-1表達(dá)的影響，探討大豆異黃酮改善學(xué)習(xí)記憶功能的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

10月齡雌性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量250～350g，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供[合格證(豫)093273]。

大豆異黃酮(SIF，純度為84%，批號060104，臨用時用0.5%羧甲基纖維素鈉配成混懸液) 華北制藥股份有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，批號F20041221) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-淀粉樣蛋白(Aβ25～35，批號 108K4794) 美國Sigma公司；戊酸雌二醇片(批號142A) 法國DELPHARM Lille S.A.S藥廠；早老素蛋白抗體、免疫組化染色試劑盒(HistostainTM-Pllus Kits，批號010686) 北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

NS型腦立體定位儀 日本Narishige公司；CX21FS1型光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Image-Pro Plus 5.1圖像處理軟件。

1.2 方法

1.2.1 造模

參照大鼠腦立體定位圖譜[3]方法，大鼠用10%水合氯醛380mg/kg(以體質(zhì)量計(jì))腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，頭頂部正中切口暴露前囟，以前囟為原點(diǎn)，向后4.4mm，旁開2.2mm為穿刺點(diǎn)，鉆孔穿顱，自腦表面進(jìn)針3.0mm至右側(cè)海馬，用微量注射器將Aβ25～35 1μL (10μg) 5min緩慢注入，留針5min，以使Aβ25～35充分浸潤局部組織，假手術(shù)組注射等量的生理鹽水。退針后縫合傷口，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉防止感染，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為6組：模型組(OVX)、大豆異黃酮高劑量組(9mg/kg，Sif-H)、大豆異黃酮中劑量組(3mg/kg，Sif-M)、大豆異黃酮低劑量組(1mg/kg，Sif-L)、假手術(shù)組(Sham)、雌二醇組(0.4mg/kg)，每組10只。各組動物均在相同環(huán)境中，自由攝食和飲水，除Sham組外，其余5組在造模3d后給藥，Sif 3組和雌二醇組每天灌胃給相應(yīng)藥物(2mL/只)，OVX組給予等體積的0.5% CMC-Na灌胃，連續(xù)21d。

1.2.3 取材

各組動物3周后，大鼠經(jīng)10%水合氯醛380mg/kg腹腔注射麻醉后，用4%多聚甲醛經(jīng)心臟行灌注固定：麻醉，剪開胸廓，見到搏動的心臟，心尖插入灌注針頭，止血鉗固定，剪開右心耳，開放靜脈血，首先快速滴入生理鹽水100～200mL，再注入4%多聚甲醛300～350mL固定液進(jìn)行固定，取腦后再置于4%多聚甲醛固定，待測大鼠腦組織海馬PS-1的表達(dá)。

1.2.4 指標(biāo)檢測

1.2.4.1 大豆異黃酮對AD大鼠跳臺實(shí)驗(yàn)的影響

大鼠學(xué)習(xí)記憶能力用跳臺實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測，手術(shù)后13d開始跳臺實(shí)驗(yàn)，跳臺儀裝置為50cm×30cm×30cm的被動反射箱，用塑料板隔成4間，箱底為銅柵，可以通電，電壓為36V，箱正中央放置高和直徑均為415cm的橡皮墊，作為大鼠逃避電擊的安全區(qū)。訓(xùn)練及測試時將大鼠放入箱中適應(yīng)3min，接通電源，大鼠受到刺激后跳到平臺上躲避電擊，若未跳到平臺則為錯誤反應(yīng)。動物從跳到平臺上至第一次跳下的時間為潛伏期，每次訓(xùn)練或測試時間為5min。大鼠第一次跳下來平臺的潛伏期即為其行為學(xué)測試成績。每天上、下午各訓(xùn)練一次，訓(xùn)練5d，記錄第6天測試成績并進(jìn)行比較。

1.2.4.2 免疫組化SP法檢測大鼠腦組織海馬PS-1的表達(dá)

將固定的腦組織進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、包埋、切片、脫蠟至水。3% H2O2溶液孵育10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)微波熱修復(fù)抗原；滴加一抗，37℃水浴箱孵育40min；滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG抗體，37℃水浴箱孵育20min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，封片；用正常羊血清代替一抗作陰性對照。

每張切片在顯微鏡下隨機(jī)取4個高倍視野觀察海馬CA1、CA2、CA3、CA4區(qū)域并拍照。神經(jīng)元胞質(zhì)及突起內(nèi)染棕黃色為PS-1陽性表達(dá)， 采用Image-Pro Plus 5.1圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)陽性表達(dá)的面積及光密度值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示， 用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，顯著性檢驗(yàn)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，以α=0.05作為有顯著性的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮對AD大鼠跳臺實(shí)驗(yàn)的影響

表1 大豆異黃酮對AD大鼠跳臺成績的影響Table 1 Effect of SIF on platform-jumping performance of step down test in AD rats

由表1可知，OVX組與Sham組相比：OVX組逃避潛伏期明顯延長，錯誤次數(shù)明顯增加，差異均具有顯著性(P＜0.01)；各治療組與OVX組相比：Sif-H組逃避潛伏期顯著減少，錯誤次數(shù)顯著降低(P＜0.01)；Sif-M、Sif-L組逃避潛伏期明顯減少，錯誤次數(shù)明顯降低(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠海馬PS-1表達(dá)

各組大鼠海馬組織表達(dá)PS-1如圖1顯示，Sham組大鼠海馬組織未見PS-1表達(dá)(圖 1B)；OVX組大鼠海馬組織PS-1呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖1A)；Sif-H組大鼠海馬組織PS-1未見明顯表達(dá)(圖1C)；Sif-M組大鼠海馬組織PS-1輕度表達(dá)(圖1D)；Sif-L組大鼠海馬組織PS-1中度表達(dá)(圖1E)；雌二醇組大鼠海馬組織PS-1呈輕、中度表達(dá)(圖1F)。

圖1 各組大鼠海馬組織的免疫組化SP法(×400)Fig.1 Streptavidin-perosidase (SP) for hippocampus of AD rats (×400)

表2 大豆異黃酮對AD大鼠海馬PS-1表達(dá)的影響Table 2 Effect of SIF on the expression of PS-1 in hippocampus of AD rats

如表2所示，OVX組大鼠海馬內(nèi)PS-1陽性表達(dá)面積和光密度明顯增加，與Sham組比較，有顯著性差異(P＜0.01)；大豆異黃酮各劑量組大鼠海馬內(nèi)PS-1陽性表達(dá)面積和光密度明顯降低，與OVX組比較有顯著性差異(P＜0.01)。

3 討 論

AD是一種較常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，病因尚未完全明了，其主要臨床特征為記憶減退和認(rèn)知功能障礙。典型的病理學(xué)特征為SP和NFT的形成。具有神經(jīng)毒性的Aβ在腦實(shí)質(zhì)沉積形成SP[4]，啟動病理級聯(lián)反應(yīng)，形成NFT，導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)元丟失。腦組織的破壞導(dǎo)致功能的損害，出現(xiàn)癡呆癥狀[5-6]。故認(rèn)為Aβ是AD各種病理變化和臨床表現(xiàn)的始發(fā)因素。本實(shí)驗(yàn)采用腦內(nèi)注射Aβ制作AD大鼠模型，并觀察到AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，PS-1活性表達(dá)增加。大豆異黃酮改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶和降低PS-1活性表達(dá)。

3.1 AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的變化

學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)方法(跳臺)，觀察了大豆異黃酮對Aβ誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性AD模型大鼠逃避潛伏期和錯誤次數(shù)法學(xué)習(xí)記憶能力的影響。結(jié)果顯示：大豆異黃酮能明顯縮短實(shí)驗(yàn)性AD模型大鼠逃避潛伏期和降低錯誤次數(shù)，從而提高實(shí)驗(yàn)性AD模型大鼠記憶獲得率。與AD模型大鼠組相比具有顯著性。表明大豆異黃酮有較好的改善實(shí)驗(yàn)性AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。

3.2 AD大鼠PS-1活性的表達(dá)

膜內(nèi)淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)為Aβ的前體蛋白，它的異常代謝使Aβ生成和聚集增多，進(jìn)而形成老年斑。β位點(diǎn)剪切酶(BACE)即β分泌酶，它在APP代謝中水解形成長度不等的Aβ40～42片段。γ-分泌酶是β產(chǎn)生所必需的另一個酶，其作用位點(diǎn)對于長Aβ片段的產(chǎn)生及AD的病理過程非常關(guān)鍵。目前認(rèn)為，γ-分泌酶為多蛋白復(fù)合體，PS-1是γ-分泌酶的催化部位和活性基團(tuán)[7-9]。PS的病理作用是促進(jìn)Aβ沉積，損傷線粒體，產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，增加 Tau 蛋白磷酸化及釋放調(diào)亡因子和提高糖原合成激酶( GSK-3β)活性而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]，最終導(dǎo)致SP和NFT的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組PS-1表達(dá)顯著加強(qiáng)，而大豆異黃酮各組PS-1表達(dá)顯著降低，說明大豆異黃酮能顯著降低AD模型大鼠的PS-1表達(dá)，從而減少SP和NFT的形成。

目前AD研究的熱點(diǎn)圍繞APP基因、PS基因和載脂蛋白E的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)提示大豆異黃酮可能通過影響AD大鼠PS-1表達(dá)來發(fā)揮類雌激素樣作用。研究大豆異黃酮對AD大鼠PS-1表達(dá)的影響，對于尋找AD防治藥物有一定意義。所以本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討仍在進(jìn)行中。

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Effect of Soybean Isoflavone on Presenilin-1 Expression in Hippocampus of Rats with Alzheimer,s Disease

FANG Zheng-qing，LIU Chang-an，WANG Yuan-jin，ZHU Jie，BAI Mei
(Research Institute of Integrated Chinese and Western Medicine, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230038, China)

Objective: To explore the effect of soybean isoflavone (SIF) on the expression of presenilin protein-1 (PS-1) in rats with Alzheimer's disease (AD). Methods: AD rat models were established by unilateral hippocampus injection of Aβ. The changes in learning and memory capability of AD rats were measured by step down test, the expression of PS-1 in hippocampus of rats were measured by immunohistochemical method. Results: Soybean isoflavone (SIF) could improve learning and memory capability of AD rats (P ＜ 0.01) by step down test, and significantly decrease the expression of PS-1 (P ＜ 0.01) in hippocampus of AD model group. Conclusion: Soybean isoflavone (SIF) can decrease PS-1 expression and improve learning and memory capability of AD rats.

soybean isoflavone；AD；β-amyloid peptide；presenilin protein-1

R285.5

A

1002-6630(2011)07-0312-03

2010-04-22

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(070413259X)

方正清(1968—)，男，副教授，碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)解剖學(xué)研究。E-mail：chhzhqfang@126.com