由 宏，郝 睿，趙功玲，朱本忠，朱 毅,*，羅云波

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100083；2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

白蘿卜提取物對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的藥效作用

由 宏1，郝 睿1，趙功玲2，朱本忠1，朱 毅1,*，羅云波1

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100083；2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

研究白蘿卜提取物對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝病的影響。實(shí)驗(yàn)用白蘿卜提取物采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法制備，使用脂肪乳劑灌胃法進(jìn)行造模，設(shè)置低、中、高3個(gè)劑量處理組，分別以0.3、1、3mL/kg的劑量對(duì)SD大鼠進(jìn)行灌胃。實(shí)驗(yàn)8周后觀察各組大鼠的肝部組織病理學(xué)特點(diǎn)，并對(duì)血清中的脂類以及脂質(zhì)過氧化相關(guān)酶類進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：與模型組相比，雄性高劑量處理組大鼠血清甘油三酯(TG)以及丙二醛(MDA)水平明顯降低，而還原性谷胱甘肽(GSH)明顯增高。此外，肝臟病理切片顯示白蘿卜提取物有助于緩解脂肪在雄性大鼠肝中的積聚，而雌性大鼠的相關(guān)指標(biāo)并無(wú)顯著性差異。因此，白蘿卜提取物可降低雄性非酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度，從而起到延緩其非酒精性脂肪肝發(fā)展的作用。

非酒精性脂肪肝；白蘿卜提取物；病理學(xué)診斷

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無(wú)過量飲酒史的以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪儲(chǔ)積為特征的臨床病理綜合征，肝臟組織學(xué)活檢表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪儲(chǔ)積、小葉內(nèi)炎癥伴氣球樣變、纖維化或Mallory透明小體[1]。包括單純性脂肪肝(liver steato)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis， NASH)和脂肪性肝硬化3個(gè)階段[2]。形成NAFLD的原因有很多，這其中主要包括日常膳食的營(yíng)養(yǎng)、使用藥物的情況、家族基因遺傳情況等。目前對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的非酒精性脂肪肝造模方法主要分為基因缺陷型造模法(如使用瘦素受體缺陷性db/db小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)[3]，營(yíng)養(yǎng)缺陷型造模法(如使用無(wú)蛋氨酸和膽堿的飼料喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)[4-5]或營(yíng)養(yǎng)過剩型造模法(如使用高脂飼料喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)[6-8]等。由于更加貼近人類患者的發(fā)病過程，營(yíng)養(yǎng)過剩型造模法被更廣泛的使用。

白蘿卜(Raphanus sativus L.)既是人們喜食的蔬菜又是我國(guó)中醫(yī)治療常用的藥物，其性味辛甘而涼；入肺、胃兩經(jīng)；具有消除積滯、清熱化痰、寬中下氣之功效[9]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)白蘿卜的研究逐漸增多，蔣全德等[10]通過實(shí)驗(yàn)表明白蘿卜提取物能夠使大鼠胃排空加快，并且這種促進(jìn)作用存在量-效關(guān)系。而脂肪類物質(zhì)的加速排空可以縮短其在體內(nèi)的保留時(shí)間，從而對(duì)脂肪在肝中的積聚起到緩解作用。JRS(日本白蘿卜提取物)也被證明對(duì)碳水化合物和脂類代謝都有著有益的影響[11]。此外，白蘿卜提取物中含有一種生物活性很強(qiáng)的芥子油苷(4-(methylthio)-3-butenyl isothiocyanate)，其已被證明有突出的抗癌、抗氧化、抗菌以及抗突變的能力[12-14]。

本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為研究對(duì)象，通過觀察肝臟病理學(xué)切片以及各項(xiàng)相關(guān)生化指標(biāo)，評(píng)價(jià)白蘿卜提取物對(duì)非酒精性脂肪肝病的治療與緩解作用，為開發(fā)利用白蘿卜及其提取物的藥用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

體質(zhì)量180～200g的健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，雌雄各半，由北京軍事科學(xué)院動(dòng)物所提供。

新鮮白蘿卜，品種為長(zhǎng)春大根，購(gòu)自北京天安農(nóng)業(yè)有限公司。

造模用脂肪乳配方參考Zou等[15]的制作方法，原材料均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。配方如下：豬油400g、蔗糖150g、全脂奶粉80g、膽固醇100g、脫氧膽酸鈉10g、吐溫-80 36.4g、陶氏丙二醇31.1g、鹽10g、飲用水300g、維生素粉2.5g、礦物質(zhì)粉1.5g。

甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒 南京建成生物工程有限公司；其余試劑由北京化工廠生產(chǎn)并提供。

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 白蘿卜提取物的制備

36kg新鮮白蘿卜，將白蘿卜洗凈切塊后使用自制小型工業(yè)榨汁機(jī)對(duì)其破碎壓榨，壓榨過程中不斷加入水和已經(jīng)榨出的白蘿卜汁，8層紗布過濾去掉沉渣后收集濾汁。將濾汁放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮后得到白蘿卜粗提物，其為黃綠色略有黏稠的液體。提取率5.72%，粗提物濃縮后1mL相當(dāng)于原生藥34.8g。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組

大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)平均分組情況如下：Ⅰ組為空白組，Ⅱ組為模型組，Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組分別為低、中、高劑量處理組(每日以0.3、1、3mL/kg劑量的白蘿卜提取物灌胃)。雌雄分開飼養(yǎng)。

1.4 造模方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)動(dòng)物一周后，除空白組外，其余各組大鼠每日以10mL/kg劑量灌胃脂肪乳。每日上午一次，連續(xù)4周。普通飼料和飲用水自由攝取。低、中、高劑量處理組在脂肪乳內(nèi)分別加入不同劑量的白蘿卜提取物(0.3、1、3mL/kg，以體質(zhì)量計(jì))?？瞻讓?duì)照組、造模組和低、中劑量組以高劑量組的攝入液體體積為基準(zhǔn)，使用同體積的生理鹽水進(jìn)行灌胃處理。

1.5 標(biāo)本的采集和處理

在第4周最后一次給藥后，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠禁食處理12h，使用無(wú)水乙醚對(duì)其進(jìn)行麻醉，取血后脫頸椎處死。觀察外觀后迅速解剖，取出肝臟后放入4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行保存。檢測(cè)時(shí)使用石蠟包埋后切片，用HE法染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)的變化。取出的血液于37℃水浴30min 后以4000r/min離心7min。取血清后放置于-80℃冰箱保存。血清生化指標(biāo)采用試劑盒酶法檢測(cè)。

1.6 測(cè)定指標(biāo)

動(dòng)物血清中指標(biāo)包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)均由北京德易生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司使用商業(yè)用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，肝臟病理學(xué)HE染色切片由北京302醫(yī)院病理科制作并拍照。

1.7 肝細(xì)胞脂肪變性程度評(píng)級(jí)

對(duì)每只大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度采用Yalniz等[16]的評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)：組織病理學(xué)切片視野中未見細(xì)胞有脂肪變性的為0級(jí)；少于25%的細(xì)胞有脂肪變性情況的為1級(jí)；25%～50%的細(xì)胞有脂肪變性情況的為2級(jí)；50%～75%的細(xì)胞有脂肪變性情況的為3級(jí)；大于75%的細(xì)胞有脂肪變性情況的為4級(jí)。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，采用組間t檢驗(yàn)，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)觀察

空白對(duì)照組動(dòng)物皮毛光亮整潔，行動(dòng)靈活，反應(yīng)迅速，體形變化較為規(guī)律。造模模型動(dòng)物目光較為呆滯，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，腰圍增長(zhǎng)很快。提取物處理組的大鼠相對(duì)模型組而言情況有所緩和。不同性別的同組大鼠特征有細(xì)微差別，雄鼠治療效果較為明顯。

2.2 肝臟及其他臟器觀察

空白對(duì)照組大鼠肝臟顏色鮮紅，表面光滑，邊緣較為銳利。造模組大鼠肝臟體積明顯增大，顏色較淺并發(fā)黃，表面無(wú)光澤，邊緣變鈍，切面有油膩感。高劑量白蘿卜提取物處理組的大鼠肝臟與空白對(duì)照組較為相似，低、中劑量白蘿卜提取物處理組的治療效果不明顯，但比造模組的情況略有好轉(zhuǎn)。

2.3 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)

圖1 各組雄性大鼠肝臟HE染色切片結(jié)構(gòu)(×100)Fig.1 HE stained hepatic sections from different groups (×100)

病理學(xué)研究表明，雄性空白對(duì)照組大鼠的HE染色切片在光鏡下結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，并無(wú)明顯病變。雄性造模組大鼠的肝臟切片普遍顯示肝細(xì)胞變大、腫脹，胞漿內(nèi)脂滴將肝細(xì)胞核擠到邊緣，病變以中央靜脈周圍最為明顯并以其為中心向外擴(kuò)散。白蘿卜提取物處理組的雄性大鼠肝組織切片在光鏡下較造模組有著不同程度的改善，呈現(xiàn)較輕的肝脂肪病變，肝細(xì)胞形態(tài)大體空白，如圖1所示。雌性大鼠的肝臟病理學(xué)變化并不明顯，未在文中提供。

2.4 各組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度評(píng)級(jí)

評(píng)級(jí)結(jié)果顯示，雄性大鼠的空白對(duì)照組中平均肝細(xì)胞脂肪變性等級(jí)為0。造模組為1.60±0.55，低劑量處理組為1.00±0.71，中劑量處理組為1.20±0.45，高劑量處理組為0.40±0.55。其中空白對(duì)照組和高劑量處理組等級(jí)顯著低于其他各組等級(jí)(P＜0.05)。雌性大鼠的評(píng)級(jí)結(jié)果均無(wú)顯著性差異。

2.5 各組大鼠血清TC、TG和HDL-C水平比較

如表1所示，造模組與空白對(duì)照組大鼠相比較，雄性組的血清TC、TG水平都有一定增加，而HDL-C水平有一定程度的降低，但均無(wú)顯著性差異。與造模組相比，高劑量處理組的雄性大鼠血清中TG水平顯著降低(P＜0.05)，而低、中劑量組的降低效果并不明顯。而雌性造模組大鼠的HDL-C水平相對(duì)空白對(duì)照組顯著降低，而雌性高劑量處理組的HDL-C水平與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。

2.6 各組大鼠血清AST、ALT和AST/ALT的水平比較

如表2所示，造模組雄性大鼠與空白對(duì)照組相比較，AST/ALT值顯著降低(P＜0.05)，而低、中劑量處理組與空白對(duì)照組相比較則無(wú)顯著性差異。高劑量處理組的AST/ALT值比所有其他組都有顯著性增高(P＜0.05)。對(duì)雌性大鼠的研究表明，雖然低、高劑量處理組的AST/ALT值都比造模組有一定的增高，但差異并無(wú)顯著性。

表1 白蘿卜提取物對(duì)各組大鼠血清TG、TC和HDL-C值的影響(n=5)Table 1 Effect of white radish extract at different doses on serum TG, TC and HDL in SD rats (n=5)

表2 白蘿卜提取物對(duì)各組大鼠血清AST、ALT和AST/ALT值的影響(n=5)Table 2 Effect of white radish extract at different doses on serum AST, ALT and AST/ALT in SD rats (n=5)

2.7 各組大鼠血清MDA和GSH水平比較

圖2 各組大鼠血清丙二醛的水平比較(n=5)Fig.2 The serum MDA levels in rats from different experimental groups (n=5)

圖3 各組大鼠血清還原型谷胱甘肽的水平比較(n=5)Fig.3 The serum GSH levels in rats from different experimental groups (n=5)

如圖2、3所示，本實(shí)驗(yàn)中雄性造模組大鼠血清中的MDA含量較空白對(duì)照組有一定的增高，而GSH含量水平則有顯著性的降低，白蘿卜提取物對(duì)這兩種脂質(zhì)過氧化相關(guān)指標(biāo)的影響非常明顯。相對(duì)于疾病造模組，處理組雄性大鼠的血清MDA水平顯著性降低(P＜0.05)，而低、高劑量組的GSH水平顯著性增高(P＜0.05)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過強(qiáng)飼法使SD大鼠攝入脂肪乳劑4周，成功地在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)模擬出了非酒精性脂肪肝的基本癥狀。但由各組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度評(píng)級(jí)結(jié)果可以看出造模組大鼠的評(píng)級(jí)并未達(dá)到文獻(xiàn)中提及的高度[16]。此外，病理學(xué)切片并未顯示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝部出現(xiàn)纖維化以及嚴(yán)重功能性損傷。因此可以判斷本實(shí)驗(yàn)中的造模組動(dòng)物僅患有肝部單純性脂肪病變，處于非酒精性脂肪肝第一階段。

通過解剖后對(duì)臟器的觀察，肝細(xì)胞脂肪變性程度評(píng)級(jí)以及病理學(xué)切片可以得出每日定量攝入的白蘿卜提取物(3mL/kg)對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的雄性實(shí)驗(yàn)大鼠肝部脂肪過度聚集、肝細(xì)胞脂肪變性都有較為明顯的改善作用。

對(duì)各組大鼠的血脂狀況研究表明，高劑量的白蘿卜提取物顯示出了較強(qiáng)的降低雄性大鼠血清中TG的能力。同時(shí)，高劑量白蘿卜提取物的處理對(duì)于緩解雌性大鼠由高脂飼料所誘導(dǎo)的高密度脂蛋白水平降低有著一定的效果。這表明高劑量的白蘿卜提取物對(duì)于大鼠的血脂代謝異常有著一定的藥效。

血清中的氨基轉(zhuǎn)移酶水平的變化是衡量肝功能的重要指標(biāo)，AST/ALT值是近年來(lái)被廣為承認(rèn)的一個(gè)評(píng)價(jià)脂肪肝發(fā)病嚴(yán)重情況的數(shù)據(jù)[17-18]，AST/ALT值越大證明肝臟越健康。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的氨基轉(zhuǎn)移酶水平的檢測(cè)結(jié)果表明，白蘿卜提取物對(duì)雄性大鼠的肝部有較為顯著的保護(hù)作用，對(duì)雌性則并無(wú)顯著影響。此外，在本實(shí)驗(yàn)中高劑量處理組的雄性大鼠的AST/ALT值顯著高于空白組(P＜0.05)，而是否過高的AST/ALT值代表一些負(fù)面的影響還有待于進(jìn)一步的研究。

MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，血清內(nèi)MDA的大量增加證明機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的增多，非酒精性脂肪肝的發(fā)病原因之一就是肝臟聚集的自由基過多。而過量的自由基引導(dǎo)的過氧化反應(yīng)可以破壞細(xì)胞膜的完整性從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的破壞。GSH是機(jī)體合成的抗氧化劑和自由基清除劑，由其制成的藥物阿拓莫蘭是治療非酒精性脂肪肝的重要輔助藥物。對(duì)于雌性大鼠而言，白蘿卜提取物對(duì)其血清MDA的含量水平同樣有顯著性的治療效果，各組間雌性大鼠的GSH值雖表現(xiàn)出一定規(guī)律，但并未顯示顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)中白蘿卜提取物可以有效抑制雌雄兩種性別大鼠體內(nèi)由于攝入高脂食品帶來(lái)的MDA大量增加。而其保護(hù)GSH不被破壞并刺激GSH生成的能力則主要在雄性大鼠體內(nèi)體現(xiàn)?？傮w而言，相對(duì)于雄性大鼠，雌性大鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多在組間沒有顯著性差異，這有可能表明雌性大鼠的肝脂代謝系統(tǒng)對(duì)外界的各種脅迫抗性都較雄性的更大。

萊菔(白蘿卜)做為傳統(tǒng)中藥一直以整體進(jìn)行應(yīng)用，因此本實(shí)驗(yàn)中白蘿卜提取物的成分并未被單獨(dú)研究。但因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)證明白蘿卜提取物對(duì)機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)有很強(qiáng)的保護(hù)作用，所以可推斷其主要成分可能是由天然強(qiáng)抗氧化劑異硫氰酸鹽(isothiocyanate)[19]以及多酚、黃酮、抗壞血酸和過氧化物酶等有較強(qiáng)的抗氧化能力的物質(zhì)組成[20]。

4 結(jié) 論

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明高劑量(3mL/kg，相當(dāng)于生藥104g)白蘿卜提取物對(duì)非酒精性脂肪肝的發(fā)展有較強(qiáng)的抑制作用，其原因可能來(lái)自于白蘿卜提取物較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化能力以及降低血液中甘油三酯積聚的能力。此外，本實(shí)驗(yàn)表明性別與脂肪肝的發(fā)病與治療效果有一定的關(guān)系，而對(duì)這方面的深入認(rèn)識(shí)還有待于進(jìn)一步的研究。

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Effect of White Radish Extract on Nonalcoholic Fatty Liver Diseases in SD Rats

YOU Hong1，HAO Rui1，ZHAO Gong-ling2，ZHU Ben-zhong1，ZHU Yi1,*，LUO Yun-bo1
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. School of Food Science, Henan Institute of Technology, Xinxiang 453003, China)

In order to exploit the medicinal value of white radish, the effect of white radish extract on the amelioration of nonalcoholic fatty liver diseases in SD rats was explored. The white radish extract was prepared with a rotary evaporator. The rats in model group were treated with fat emulsion with white radish extract by gavage at the doses of 0.3, 1 mL/kg and 3 mL/kg. The pathological characteristics of liver tissues in rats with 8 weeks experiments were analyzed. Meanwhile, serum lipid and lipid peroxidases were determined. The results indicated that white radish extract at a high dose could significantly decrease the levels of serum TG and MDA and increase the levels of GSH in male rats. Moreover, white radish extract could alleviate the accumulation of lipid in the hepatocytes of male rats. However, no obvious change of these parameters in female rats was observed. Therefore, white radish extract can ameliorate nonalcoholic fatty liver diseases in SD male rats by decreasing the level of lipid peroxidation.

nonalcoholic fatty liver disease；white radish extract；pathological diagnosis

R151.3

A

1002-6630(2011)07-0300-05

2010-09-06

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2009-1-86)

由宏(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：a_you_hong@163.com

*通信作者：朱毅(1973—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：zhuyi_cau@126.com