吳少杰，焦豫良，朱 強(qiáng)，馬桂珍，王淑軍

(淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

海洋擬諾卡氏菌株HY-G轉(zhuǎn)化大豆異黃酮苷發(fā)酵條件的優(yōu)化

吳少杰，焦豫良，朱 強(qiáng)，馬桂珍，王淑軍

(淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

目的：優(yōu)化大豆異黃酮苷微生物轉(zhuǎn)化的發(fā)酵條件。方法：利用本實(shí)驗(yàn)室篩選出的海洋擬諾卡氏菌株HY-G進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，采用單因素和正交試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成及條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：篩選的最佳發(fā)酵工藝為在高氏一號(hào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1g/100mL蔗糖、0.03g/100mL硫酸銨和200mg/L誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基裝液量150mL/250mL，起始pH8.0，培養(yǎng)溫度40℃，搖瓶轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)72h。優(yōu)化后的酶活力分別達(dá)3621U/mL(對(duì)染料木素)和4862U/mL(對(duì)大豆苷元)。結(jié)論：經(jīng)過(guò)優(yōu)化，得出了較好的產(chǎn)酶發(fā)酵工藝，有利于進(jìn)一步采用大規(guī)模發(fā)酵法轉(zhuǎn)化大豆異黃酮苷元。

擬諾卡氏菌株HY-G；大豆異黃酮；水解酶；生物轉(zhuǎn)化；發(fā)酵條件

大豆是一種歷史悠久的傳統(tǒng)食品，其中富含蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)成分及多種生理活性物質(zhì)，大豆異黃酮(soybeans isoflavones，SI)是大豆的主要功能性活性成分之一。大豆異黃酮具有人類(lèi)雌性激素相似的結(jié)構(gòu)和生理活性而被稱(chēng)之為植物性雌激素。大豆異黃酮能夠用于防治多種疾病，例如癌癥、婦女更年期綜合癥、心腦血管疾病及骨質(zhì)疏松等[1-3]。

目前從豆類(lèi)中分離得到的大豆異黃酮包含12種異黃酮類(lèi)成分，其母體為3種異黃酮苷元，即染料木素(genistein)、大豆苷元(daidzein)和黃豆黃素(glycitein)，這3種苷元又分別與含有不同修飾基團(tuán)的葡萄糖基相結(jié)合，形成9種異黃酮苷類(lèi)，統(tǒng)稱(chēng)為染料木苷(genistin)、大豆苷(daidzin)和黃豆黃苷(glycitin)。大豆中95%～99%的異黃酮都是以苷的形式存在，苷元的含量很少[4]。大豆異黃酮的存在形式對(duì)其生物活性和生物利用度有著顯著的影響。研究表明，苷元形式的大豆異黃酮比大豆異黃酮苷具有更好的吸收速率[5]，將大豆異黃酮苷轉(zhuǎn)化成苷元能顯著提高其吸收效率和生物利用度[6-7]；體外實(shí)驗(yàn)也表明，大豆異黃酮苷元比大豆異黃酮苷具有更好的雌激素樣生物活性[8]。盡管這方面還存在一定的爭(zhēng)議[9]，但是國(guó)內(nèi)外許多研究者都致力于提高各種大豆食品中異黃酮苷元的含量[10]。目前市場(chǎng)上，大豆異黃酮苷元的價(jià)格也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大豆異黃酮苷[11]。

本實(shí)驗(yàn)室從海洋放線(xiàn)菌中篩選到一株高產(chǎn)大豆異黃酮苷水解酶的菌株HY-G，經(jīng)鑒定屬于較為稀有的海洋擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis sp.)。研究表明，該菌株所產(chǎn)的大豆異黃酮苷水解酶是一種較特殊的β-葡萄糖苷酶，具有與其他來(lái)源的β-葡萄糖苷酶所不同的性質(zhì)，可能是一種新酶。本實(shí)驗(yàn)對(duì)海洋擬諾卡氏菌株HY-G產(chǎn)生大豆異黃酮苷轉(zhuǎn)化酶的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期為利用該菌株轉(zhuǎn)化大豆異黃酮苷、生產(chǎn)高價(jià)值的大豆異黃酮苷元提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

染料木苷(genistin)、大豆苷(daidzin) 石家莊工大生物制品有限公司；染料木素、大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品 上海同田生物技術(shù)有限公司；硅膠薄層層析板 安徽皖西硅源材料廠(chǎng)；其他藥品均為分析純。

CR22G高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 舟山市定海區(qū)海源儀器廠(chǎng)；HD2200型超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；CS-9301PC雙波長(zhǎng)飛點(diǎn)掃描薄層分析儀(配有CS-9301數(shù)據(jù)處理工作站) 日本島津公司。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

海洋擬諾卡氏菌(Nocardiopsis sp.)菌株HY-G，由本實(shí)驗(yàn)室分離自海洋環(huán)境，目前保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號(hào)：CCTCC 2010126)。

固體斜面培養(yǎng)基(海水高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基)：可溶性淀粉20g、KNO31g、NaCl 0.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·H2O 0.01g、瓊脂粉20g、海水1000mL，pH7.4～7.6。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：在不加瓊脂的海水高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基中，添加一定量的大豆異黃酮苷作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)產(chǎn)生大豆異黃酮苷水解酶。

1.3 方法

1.3.1 菌種的發(fā)酵

采用搖瓶發(fā)酵法，在250mL三角瓶中加入一定體積的液體培養(yǎng)基，接種后，于37℃、120r/min培養(yǎng)48～72h。

1.3.2 胞內(nèi)酶的提取

上述液體發(fā)酵培養(yǎng)物于8000r/min離心10min，收獲菌體。菌體用0.1mol/L pH6.8的Tris-HCl緩沖溶液洗滌兩次并離心后，加入5mL的上述緩沖液重新懸浮菌體，在冰浴的條件下，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體細(xì)胞，操作條件為：功率100W、破碎10s，間隔5s。然后在12000r/min條件下離心20min除去菌體碎片，上清液即為粗酶液。

1.3.3 糖苷型大豆異黃酮的酶水解

用0.1mol/L的Tris-HCl(pH6.8)緩沖液將大豆異黃酮苷配成質(zhì)量濃度約10mg/mL的底物溶液(可加適量乙醇助溶)。取0.5mL粗酶液和0.5mL底物溶液混合，40℃反應(yīng)1h后，用2mL乙酸乙酯萃取水解產(chǎn)物。取萃取物10～20μL作薄層層析(thin layer chromatography，TLC)。展開(kāi)劑為氯仿與甲醇體積比10:7，展開(kāi)約6cm后，揮干溶劑，用雙波長(zhǎng)薄層掃描儀掃描，根據(jù)斑點(diǎn)面積的積分值計(jì)算酶活力。

1.3.4 大豆異黃酮苷元的測(cè)定

首先配制不同質(zhì)量濃度的染料木素和大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別取各質(zhì)量濃度的染料木素和大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL作薄層層析展開(kāi)后進(jìn)行薄層掃描測(cè)定。測(cè)定時(shí)，采用反射單波長(zhǎng)鋸齒掃描法，測(cè)定波長(zhǎng)為260nm，光斑大小為0.07mm×0.07mm。所得到的測(cè)定數(shù)據(jù)通過(guò)儀器自帶的CS-9301軟件進(jìn)行底線(xiàn)校正、峰面積計(jì)算等處理，得出大豆異黃酮苷元的峰面積值。分別以染料木素和大豆苷元的質(zhì)量m(μg)為橫坐標(biāo)、薄層掃描峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得染料木素和大豆苷元的回歸方程分別為A = 20.355746＋224.86243m (R2=0.99597)、A=70.932704＋224.69326m(R2=0.99538)。通過(guò)上述回歸方程，計(jì)算出樣品液中的大豆異黃酮苷元含量，進(jìn)而計(jì)算酶活力。

1.3.5 酶活力的測(cè)定

分別以染料木苷和大豆苷為底物，酶活力的測(cè)定按照1.3.4節(jié)方法進(jìn)行。酶活力單位的定義是在上述測(cè)定條件下，每小時(shí)釋放1nmol水解產(chǎn)物的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)，即：

式中：m為產(chǎn)物的生成總質(zhì)量/μg；M為產(chǎn)物的摩爾質(zhì)量/(g/mol)；t為酶反應(yīng)時(shí)間/h；V為酶液體積/mL。

1.3.6 單因素及正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，得出最佳的培養(yǎng)基組成(碳源和氮源的種類(lèi)與質(zhì)量濃度、產(chǎn)酶誘導(dǎo)物的質(zhì)量濃度等)。利用上述培養(yǎng)基組成，分別研究了培養(yǎng)基起始pH值、培養(yǎng)溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素的作用水平。在單因素研究基礎(chǔ)上，選定培養(yǎng)時(shí)間、起始pH值、裝液量、培養(yǎng)溫度為因素，進(jìn)行了L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

以不含可溶性淀粉的海水高氏一號(hào)液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入1mL/100mL的10°麥芽汁和1g/100mL的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥麩作為碳源，氮源為0.1g/100mL的硝酸鉀，按照1.3.1節(jié)發(fā)酵方法培養(yǎng)48h后測(cè)定其酶活力，以在高氏一號(hào)培養(yǎng)液體發(fā)酵基中的酶活力作為100%，結(jié)果如表2所示。

表2 不同碳源對(duì)大豆異黃酮苷水解酶產(chǎn)酶的影響Table 2 Effect of carbon source on the production of hydrolases for SI

從表2可見(jiàn)，淀粉、蔗糖對(duì)于產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，而葡萄糖、麥麩、麥芽汁不利于產(chǎn)酶，這可能與微生物的葡萄糖效應(yīng)有關(guān)，即當(dāng)培養(yǎng)基中存在著更容易利用的糖(如葡萄糖)時(shí)，微生物就較少產(chǎn)生利用其他糖的酶類(lèi)。在葡萄糖存在的情況下，微生物產(chǎn)生大豆異黃酮苷酶分解大豆異黃酮獲得葡萄糖的壓力不大，因而影響產(chǎn)酶。

2.1.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

以不含硝酸鉀的海水高氏一號(hào)液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以可溶性淀粉為碳源，分別添加0.1g/100mL的NaNO3、(NH4)2SO4、蛋白胨、酵母膏和牛肉膏為氮源，按照1.3.1節(jié)發(fā)酵方法進(jìn)行培養(yǎng)48h后測(cè)定其相對(duì)酶活力，以在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中的酶活力作為100%，結(jié)果見(jiàn)表3。該菌株能夠很好地利用無(wú)機(jī)氮源，產(chǎn)生的酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以有機(jī)氮為氮源、而且無(wú)論是對(duì)無(wú)機(jī)氮源中的硝態(tài)氮還是氨態(tài)氮，都能夠很好地利用，其中以硫酸銨為氮源最好；而有機(jī)氮源中，以蛋白胨為氮源產(chǎn)酶活力最高。由于有機(jī)氮源價(jià)格低廉，因此，在采用發(fā)酵法轉(zhuǎn)化大豆異黃酮時(shí)，該菌株有著較大的優(yōu)勢(shì)。

表3 不同氮源對(duì)大豆異黃酮苷水解酶產(chǎn)酶的影響Table 3 Effect of nitrogen source on the production of hydrolases for SI

2.1.3 最佳碳源和氮源作用的質(zhì)量濃度

為了解最佳碳源和氮源最適添加量，根據(jù)上述結(jié)果確定的最佳碳源和氮源，在不含氮源和碳源的海水高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度的蔗糖(0.1～10g/100mL)和硫酸銨(0.01～1g/100mL)，然后按照1.3.1節(jié)發(fā)酵方法培養(yǎng)48h后，測(cè)定其酶活力。結(jié)果如圖1所示。

圖1 最佳碳源(a)和最佳氮源(b)添加量對(duì)大豆異黃酮水解酶產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of amounts of optimal carbon source and optimal nitrogen source on the production of produce large amounts of hydrolases for SI

由圖1可以看出，碳源的添加量以1g/100mL左右較為合適，低于1g/100mL，則由于菌體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)不足而導(dǎo)致產(chǎn)酶能力迅速下降，高于1g/100mL則產(chǎn)酶有下降的趨勢(shì)，可能是由于培養(yǎng)基中糖類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分充足，菌株通過(guò)分泌水解酶獲取額外葡萄糖的壓力不大。對(duì)于最佳氮源的添加量，在實(shí)驗(yàn)所選的氮源質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，總體酶活力維持在較高的水平，其中以0.03g/100mL最好，低于0.03g/100mL時(shí)，由于氮源的不足，對(duì)產(chǎn)酶有較大影響；高于0.03g/100mL也會(huì)使產(chǎn)酶下降，但仍保持一定的產(chǎn)酶量。

2.1.4 誘導(dǎo)物質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖2 誘導(dǎo)物質(zhì)量濃度對(duì)大豆異黃酮水解酶產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of inducer concentration on the production of produce large amounts of hydrolases for SI

在高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基中，分別添加10、50、100、150、200、300mg/L和500mg/L的大豆異黃酮苷作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物，考察誘導(dǎo)物對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)大豆異黃酮苷的添加量＜150mg/L時(shí)，產(chǎn)酶受到較大影響，表明該菌株產(chǎn)生的大豆異黃酮苷水解酶屬于誘導(dǎo)酶，需要有外界底物存在才能夠誘導(dǎo)合成。另外，由于大豆異黃酮苷難溶于水，因此其添加量以150～200mg/L為宜，過(guò)多添加對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶作用不大。

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2.1 起始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖3 起始pH值對(duì)大豆異黃酮水解酶產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of initial pH on the production of produce large amounts of hydrolases for SI

在上述最佳培養(yǎng)基組成下，考察起始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。起始pH值為6～7時(shí)，其酶活力最大。pH值低于6.0則生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力急劇下降；pH值高于8.0時(shí)，其生長(zhǎng)和產(chǎn)酶呈下降趨勢(shì)，但下降速度比較緩慢，說(shuō)明海洋擬諾卡氏菌株HY-G比較能夠耐受堿性條件，這可能與其在自然界生長(zhǎng)的海洋環(huán)境有關(guān)。

2.2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)大豆異黃酮水解酶產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the production of produce large amounts of hydrolases for SI

按照上述篩選出的最佳產(chǎn)酶條件，將培養(yǎng)基分別置于18、23、28、33、38、45℃和50℃條件下160r/min搖床中培養(yǎng)72h，然后測(cè)其酶活力，結(jié)果如圖4所示。溫度在23～38℃范圍內(nèi)酶的產(chǎn)生量比較穩(wěn)定，產(chǎn)酶量也達(dá)到最大；低于23℃或超過(guò)45℃則微生物生長(zhǎng)受到抑制而影響產(chǎn)酶。雖然該菌株在23～38℃范圍內(nèi)培養(yǎng)72h后產(chǎn)酶量變化不大，但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在此溫度范圍內(nèi)，溫度越高，微生物生長(zhǎng)越快，如在38℃條件下培養(yǎng)48h即可達(dá)到最大酶活力，而在28℃條件下培養(yǎng)，則需要72h。

2.2.3 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖5 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)大豆異黃酮水解酶產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of rotation speed on the production of produce large amounts of hydrolases for SI

在上述最佳條件的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基分別置于不同轉(zhuǎn)速(0、60、120、180、200r/min)的搖床中培養(yǎng)，考察搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖5所示。在60～120r/min下，菌體產(chǎn)酶量較高；轉(zhuǎn)速高于120r/min，由于剪切力的影響，不利于產(chǎn)酶。結(jié)果還表明，在較低轉(zhuǎn)速下，海洋擬諾卡氏菌株HY-G生長(zhǎng)和產(chǎn)酶均較好，說(shuō)明其生長(zhǎng)代謝對(duì)溶氧的要求并不是很高。

2.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

將培養(yǎng)基于28℃、120r/min搖床中分別培養(yǎng)不同時(shí)間(24、36、48、60、72、84、96、108、120h)，然后測(cè)其酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖6。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至72h后，產(chǎn)酶達(dá)到高峰后，若繼續(xù)培養(yǎng)，可能由于菌體產(chǎn)生蛋白酶破壞大豆異黃酮水解酶等原因，使得酶活力降低。

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大豆異黃酮水解酶產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of incubation time on the production of produce large amounts of hydrolases for SI

2.3 培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)

表4 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Scheme and experimental results of orthogonal array design

TLC點(diǎn)樣量為10μL。從表4可以看出，若以染料木素的產(chǎn)生量為標(biāo)準(zhǔn)，則各影響因素的主次關(guān)系為：培養(yǎng)溫度＞裝液量＞起始pH值＞培養(yǎng)時(shí)間，最佳組合為：培養(yǎng)溫度40℃、裝液量150mL/250mL、起始pH8.0、培養(yǎng)時(shí)間96h；若以大豆苷元為標(biāo)準(zhǔn)，各影響因素的主次關(guān)系與對(duì)染料木素一致，最佳組合也類(lèi)似，唯一不同的是最佳培養(yǎng)時(shí)間為72h。由于培養(yǎng)時(shí)間各水平間差異不大、影響最不顯著，即影響因素的主次關(guān)系為：培養(yǎng)溫度＞裝液量＞起始pH值＞培養(yǎng)時(shí)間，最佳組合為：培養(yǎng)溫度40℃、裝液量150mL/250mL、起始pH8.0、培養(yǎng)時(shí)間72h。

2.4 優(yōu)化后的產(chǎn)酶活力測(cè)定

按照上述實(shí)驗(yàn)篩選的最佳條件和最佳培養(yǎng)基組成，即在高氏一號(hào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1g/100mL蔗糖、0.03g/100mL硫酸銨和200mg/L誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基裝液量150mL/250mL，起始pH8.0，培養(yǎng)溫度40℃，搖瓶轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)72h后，測(cè)定菌體破碎液中的酶活力分別為3621U/mL(對(duì)染料木素)和4862U/mL(對(duì)大豆苷元)。

3 討 論

雖然針對(duì)大豆異黃酮苷酶水解的研究較多，但在測(cè)定酶活力時(shí)，多采用對(duì)硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(p-NPG)作底物，因此，難以反映酶對(duì)大豆異黃酮苷的活力大小。迄今僅有少數(shù)人測(cè)定了以對(duì)大豆異黃酮苷為底物的酶活力，例如，謝明杰等[12]測(cè)定了犁頭霉菌株R(Absidia sp. R)中大豆異黃酮苷水解酶的酶活力，為82U/mL(對(duì)染料木素)。相比之下，本實(shí)驗(yàn)中的酶活力數(shù)值顯得相當(dāng)高，但是仔細(xì)分析可以發(fā)現(xiàn)，犁頭霉菌株R產(chǎn)生的是胞外酶，故文獻(xiàn)中直接將發(fā)酵液作為粗酶液，酶液濃度較稀；而本研究中擬諾卡氏菌株HY-G產(chǎn)生的是胞內(nèi)酶，需收集菌體、用少量緩沖液重新懸浮并破碎細(xì)胞，前后大約濃縮了30余倍。因此和犁頭霉菌株R相比，同體積的發(fā)酵液中，擬諾卡氏菌株HY-G產(chǎn)生的酶活力估計(jì)約為100～120U/mL，比犁頭霉菌株R稍高，這表明該菌株也是一株較為優(yōu)良的大豆異黃酮苷水解菌株。

另外，研究還發(fā)現(xiàn)，菌株HY-G產(chǎn)生的大豆異黃酮水解酶對(duì)大豆苷的活力要高于染料木素。由于染料木素分子C5上比大豆苷元多一個(gè)羥基[13]，推測(cè)有可能是因?yàn)樵摶鶊F(tuán)的存在造成了空間位阻，對(duì)酶的作用產(chǎn)生一定影響。

目前，采用微生物轉(zhuǎn)化法水解大豆異黃酮苷的研究較多，但所采用的菌株多屬于霉菌類(lèi)，例如黑曲霉[14]、米曲霉[15-16]、少孢根霉[17]、嗜熱擬青霉[18]等，也有采用細(xì)菌的，例如鏈球菌[10]、雙歧桿菌[19]等，采用放線(xiàn)菌轉(zhuǎn)化則比較少見(jiàn)。海洋擬諾卡氏菌HY-G屬于放線(xiàn)菌類(lèi)，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到該屬微生物產(chǎn)生大豆異黃酮苷水解酶(或β-葡萄糖苷酶)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)海洋擬諾卡氏菌株HY-G的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶特性進(jìn)行了初步優(yōu)化，得出了其產(chǎn)生大豆異黃酮苷酶的合適條件。

采用微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的工藝，通常有發(fā)酵法和酶水解法兩種類(lèi)型，前者直接利用微生物發(fā)酵，而后者是從微生物中提取出酶，再利用酶進(jìn)行催化水解。相比而言，發(fā)酵法具有較高的成本優(yōu)勢(shì)。海洋擬諾卡氏菌株HY-G不僅具有較高的大豆異黃酮水解酶活力，而且具有營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、培養(yǎng)條件溫和、對(duì)溶氧要求不高等特點(diǎn)，有利于進(jìn)行大規(guī)模液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元。同時(shí)，由于海洋擬諾卡氏菌株HY-G在液體發(fā)酵中能形成菌絲體，很容易收集細(xì)胞用于胞內(nèi)酶的提取，因此也為采用酶水解法提供了較好的條件。

4 結(jié) 論

本研究利用海洋擬諾卡氏菌株HY-G生物轉(zhuǎn)化大豆異黃酮苷，采用單因素和正交試驗(yàn)法，對(duì)發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成等發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的酶活力分別達(dá)3621U/mL(對(duì)染料木素)和4862U/mL(對(duì)大豆苷元)。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，得出了較好的產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件，有利于進(jìn)一步采用大規(guī)模發(fā)酵法轉(zhuǎn)化大豆異黃酮苷，得到生物活性和生物利用度都較好的大豆異黃酮苷元。

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Optimization of Fermentation Conditions for Soybean Isoflavone Biotransformation by Marine Nocardiopsis sp. HY-G

WU Shao-jie，JIAO Yu-liang，ZHU Qiang，MA Gui-zhen，WANG Shu-jun
(College of Marine, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Objective: Nocardiopsis sp. HY-G, a strain isolated from marine environment by our laboratory, has been found to produce large amounts of hydrolases that can transform soybean isoflavones (SI) into genistein and daidzein during fermentation. In this study, medium composition and fermentation conditions for decomposing SI by the strain were optimized. Methods: Single factor and orthogonal array design methods were combinedly used for the optimization of fermentation conditions and medium composition. Results: The optimal fermentation medium was Gausse No.1 medium fortified with 1 g/100 mL sucrose, 0.03 g/100 mL (NH4)2SO4, 200 mg/L SI and initial pH 8.0. Fermentation temperature of 40 ℃, rotation speed of 120 r/min and fermentation time of 72 h in a 250 mL shake flask with 150 mL of medium were found optimum for culturing the strain. The activity towards the substrate genistein of the resulting product was 3621 U/mL and the activity towards daidzin was 4862 U/mL. Conclusion: The optimum fermentation conditions obtained after optimization are true and reliable, which will be helpful for large scale biotransformation of SI.

Nocardiopsis sp. HY-G；soybean isoflavone；hydrolysase；biotransformation；fermentation condition

Q815

A

1002-6630(2011)07-0273-06

2010-08-19

江蘇省教育廳高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(08KJB180001)；淮海工學(xué)院引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(KQ08015)

吳少杰(1973—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛夹g(shù)。E-mail：shjwu@163.com