蔣 蕓，嚴文靜，劉麗強，匡 華，陳 偉，張 坤，胥傳來,*

(1.蘇州大學分析測試中心，江蘇 蘇州 215123；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

重金屬汞螯合物人工抗原的合成與鑒定

蔣 蕓1，嚴文靜2，劉麗強2，匡 華2，陳 偉2，張 坤2，胥傳來2,*

(1.蘇州大學分析測試中心，江蘇 蘇州 215123；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

以重金屬汞為起始物質(zhì)，將其離子化為二價汞，與雙功能螯合劑谷胱甘肽(GSH)螯合后，獲得半抗原，然后將半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)進行偶聯(lián)，獲得完全抗原。實驗對各步驟的反應條件進行優(yōu)化，采用紫外光譜、凝膠電泳對產(chǎn)物進行表征，成功制備了汞-GSH-BSA完全抗原。為計算完全抗原中重金屬和載體蛋白的偶聯(lián)比，采用石墨爐原子吸收法測定產(chǎn)物中重金屬汞的含量，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定抗原中載體蛋白的含量，所制備的免疫原中汞和蛋白的偶聯(lián)比是9:1。Hg-GSH-BSA的成功合成是制備可識別重金屬汞螯合物抗體的基礎。

汞；重金屬；免疫學檢測；雙功能螯合劑；抗原

重金屬污染給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來嚴重的危害，特別是汞，因其環(huán)境行為的復雜性和毒性，引起了廣泛關注[1-4]。汞及其化合物所造成的生態(tài)污染問題日益嚴重，汞沿著食物鏈的累積，可以通過多種途徑進入人體，對人的呼吸系統(tǒng)、皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟和眼睛等造成嚴重傷害[5-8]。重金屬免疫學檢測技術具有檢測速度快、費用低廉、靈敏度高和選擇性強等優(yōu)點，可用于環(huán)境樣品重金屬篩查、農(nóng)畜產(chǎn)品的抽樣檢測及進出口通關的快速檢驗中。重金屬免疫檢測技術以重金屬螯合物特異性單克隆抗體為基礎，而成功制備重金屬免疫原是制備單克隆抗體的關鍵[9-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

汞、牛血清蛋白、鑰孔戚血藍素(KLH)、卵清蛋白(OVA) 美國Sigma公司；乙二胺四乙酸(EDTA) 北京精益化工廠；二乙烯三胺五乙酸(DTPA) 上海同仁化學研究所；羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 華美生物工程公司； BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒 德國Merck公司；Milli-Q超純水 美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

自動高速冷凍離心機 日立(上海)儀器有限公司；賽多利斯arium 611UF實驗室超純水器 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；UV2V IS8500型分光光度計 Unico(上海)儀器有限公司；ENWAY 3520 pH計 基因有限公司；Power PAC3000型電泳儀 美國Bio-Rad公司；DYCZ-24DN(小號) 雙垂直電泳槽 東莞市麥亙生物科技有限公司；IKA磁力攪拌器 廣州儀科實驗室技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 完全抗原的制備

取10mg 金屬汞，溶于5mL 濃硝酸中，待其完全溶解后補加超純水至50mL，調(diào)制成1mmol/L 的Hg2+溶液待用。

采用水溶性碳化二亞胺(EDC)偶聯(lián)牛血清白蛋白(BSA)與谷胱甘肽(GSH)。用去離子水分別配制5mg/mL的GSH、0.5%的EDC。BSA 20mg溶于1.4mL pH7.4的HEPES (10mmol/L)緩沖液中，取0.6mL質(zhì)量濃度為5mg/mL的GSH逐滴滴加到1.4mL的BSA中，再加入2mL 0.5% EDC，25℃反應8h，調(diào)節(jié)pH值至7.4，25℃反應4h。

反應物純化后加入50μL的lmmol/L的Hg2+溶液，25℃反應6h。用磁力攪拌器對反應液進行透析，透析3d，小分子物質(zhì)被濾去。即形成完全抗原BSAGSH-Hg2+。

1.3.2 無金屬抗原BSA-GSH的制備

用去離子水分別配制5mg/mL的GSH、0.5%的EDC。BSA 20mg溶于1.4mL pH7.4的HEPES(10mmol/L)緩沖液中，再加入2mL 0.5% EDC，25℃反應8h，調(diào)節(jié)pH值至7.4，25℃反應4h。

反應物純化后加入50μL的超純水，25℃反應6h。用磁力攪拌器對反應液透析，透析3d。小分子物質(zhì)被濾去。即形成無金屬抗原BSA-GSH。

1.3.3 合成抗原的鑒定

1.3.3.1 蛋白質(zhì)量濃度測定

將純化后的抗原按照BCA蛋白檢測試劑盒(DiacloneTM)說明書上的方法測定蛋白質(zhì)量濃度?？乖馁|(zhì)量濃度測定以BSA作為標準蛋白，用BCA法構(gòu)建質(zhì)量濃度檢測標準曲線。標準曲線的線性方程為：y=0.0013x-0.0015，線性相關系數(shù)為R2=0.9999，式中：y為樣品在波長562nm處吸光度；x為樣品蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.3.2 半抗原、抗原與載體蛋白的紫外光譜

以0.1mol/L、pH7.4 HEPES作為空白對照，取50μL BSA及其相應的抗原，用HEPES稀釋至1mg/mL；取20μL半抗原，用HEPES稀釋10倍，再用去離子水稀釋5倍。在波長200～320nm范圍內(nèi)進行紫外掃描。

1.3.3.4 抗原中Hg2+含量的測定

以0.1mol/L、pH7.4的HEPES作為空白對照， 將離心純化后的抗原用0.1mol/L、pH7.4 HEPES稀釋100倍，參照國標GB/T 17141—1997《土壤質(zhì)量 鉛、鎘的測定 石墨爐原子吸收分光光度法》，用石墨爐原子吸收光譜法檢測抗原中Hg2+的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原中蛋白質(zhì)量濃度的檢測

利用BCA 法檢測分離純化后的Hg2+-GSH-BSA、 GSH-BSA中蛋白的質(zhì)量濃度依次為(7.550±0.346)、(7.219±0.124)mg/mL(表1)。

表1 BCA法檢測抗原中蛋白質(zhì)量濃度Table 1 Carrier protein concentration in antigen determined by BCA method

2.2 紫外掃描定性分析

圖1 紫外掃描載體蛋白和抗原的圖譜Fig.1 UV scanning spectra of carrier protein and antigen

如圖1 所示，BSA在波長227.5nm處和278nm處有一個吸收峰；半抗原BSA-GSH在波長218～235nm處有強吸收峰(吸光度均在0.5以上)，屬于高吸收值的區(qū)域；半抗原與載體蛋白相比，BSA-GSH的最大吸收波長發(fā)生了漂移，在波長218～235nm之間出現(xiàn)特征吸收峰。BSA-GSH-Hg2+在波長228.7nm處出現(xiàn)強吸收峰，在波長218～240nm之間出現(xiàn)高吸收值。結(jié)合以上信息，抗原BSA-GSH-Hg2+的紫外掃描特征既具有BSA的特征，又具有半抗原BSA-GSH的特征，證明抗原合成成功。

2.3 抗原SDS-PAGE電泳鑒定

圖2 抗原SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of antigen

由圖2可以看出，由于BSA上交聯(lián)有螯合劑GSH，與BSA相比，分子質(zhì)量變大，BSA-GSH電泳條帶滯后且較模糊。同理BSA-GSH-Hg2+與BSA-GSH及BSA相比，分子質(zhì)量變大，且由于Hg2+帶正電，所以電泳條帶滯后且模糊。由此可定性判斷抗原合成成功。

2.4 石墨爐原子吸收光譜法檢測抗原中Hg2+的含量

通過石墨爐原子吸收光譜法對產(chǎn)物Hg2+-GSH-BSA、GSH-BSA、HEPES中的Hg2+含量進行測定，其結(jié)果依次為：(206.4±0.7)、0、0μg/mL。進一步表明半抗原確實偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上，證明抗原合成成功。

2.5 計算偶聯(lián)比

通過計算，Hg的含量為1.029×10-6mol/mL；BSA的含量為0.1127×10-6mol/mL。Hg和BSA的偶聯(lián)比為1.029:0.1127=9.131:1≈9:1。

3 結(jié)論與討論

重金屬離子免疫檢測的關鍵在于重金屬螯合物特異性單克隆抗體的制備，重金屬螯合物特異性單克隆抗體制備的關鍵又在于重金屬免疫原的制備。由于Hg2+能與動物體內(nèi)生物分子發(fā)生強烈的不可逆反應，導致動物中毒，本實驗選擇了多氨基羧基化合物(谷胱甘肽)作為螯合劑，制備Hg2+人工抗原。

首先使谷胱甘肽和大分子蛋白結(jié)合形成大分子物質(zhì)，再使谷胱甘肽上的二硫鍵和汞離子結(jié)合形成較穩(wěn)定的復合體。汞離子此時就像一顆鉆石鑲嵌在大分子蛋白上，周圍包裹汞離子的基團較少，這樣使得汞離子獲得一個空間表象，從而使得BSA-谷胱甘肽-汞離子的復合物具有較好的免疫原性和抗原反應性，可以使免疫系統(tǒng)間接對汞離子產(chǎn)生識別反應。

在免疫動物之前，需要對重金屬抗原進行結(jié)構(gòu)表征。本實驗通過對抗原及相應載體蛋白的紫外光譜進行測定，并結(jié)合SDS-PAGE電泳結(jié)果，定性判定抗原合成是否成功。經(jīng)鑒定合成成功的抗原，利用石墨爐原子吸收光譜法檢測抗原中的Hg2+含量，并使用BCA試劑盒獲得偶聯(lián)載體蛋白的量，求得產(chǎn)物的偶聯(lián)比率是9:1，該研究成果為重金屬螯合物單克隆抗體的制備提供了參考。

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Synthesis and Identification of Artificial Antigen for Mercury Chelate

JIANG Yun1，YAN Wen-jing2，LIU Li-qiang2，KUANG Hua2，CHEN Wei2，ZHANG Kun2，XU Chuan-lai2,*
(1. Analytical Center, Suzhou University, Suzhou 215123, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Mercury was used as the initial material to chelate GSH and obtain a bi-functional hepten of Hg-GSH chalete. The hapten was then coupled with the carrier protein such as bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin (OVA) to obtain a complete antigen, Hg-GSH-BSA (OVA), whose successful synthesis was confirmed by ultra-violet spectrum and SDS-PAGE. On the basis of mercury content in synthesized products determined by atomic absorption spectrometry and the amount of carrier protein determined by bicinchoninic acid (BCA) assay, the coupling ratio between mercury and carrier protein calculated to be 9:1. The successful synthesis of Hg-GSH-BSA conjugate may lay a basis for preparing recognizing antibodies of mercury chelate.

mercury；heavy metal；immunoassay；bifunctional chelating agent；antigen

TS207.5

A

1002-6630(2011)07-0244-03

2010-07-16

蔣蕓(1979—)，女，實驗師，碩士，研究方向為重金屬殘留檢測。E-mail：jiangyun@suda.edu.cn

*通信作者：胥傳來(1965—)，男，教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn