王 芳，龐廣昌*，王景川

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津 300134)

螺旋藻β-胡蘿卜素代謝控制分析及其新方法的研究

王 芳，龐廣昌*，王景川

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津 300134)

代謝控制分析(MCA)的兩大難題是獲得酶活性的擾動和通量控制系數(shù)(FCC)的計算，需要借助基因操作和復(fù)雜的計算推理。研究表明數(shù)量性狀基因座(QTL)效應(yīng)和通量控制系數(shù)(FCC)具有極其相似的分布規(guī)律，均呈L形分布，即代謝通量具有與數(shù)量性狀一致的遺傳變異規(guī)律。因此，本實驗將螺旋藻(Spirulina)β-胡蘿卜素(β-carotene)的代謝通量作為一個數(shù)量性狀，運用主成分分析、通徑分析等數(shù)量遺傳學分析方法研究其代謝途徑中酶對通量的影響方式和程度。在相關(guān)分析的基礎(chǔ)上計算得到了基于主成分分析的控制系數(shù)Cpi和基于通徑分析的控制系數(shù)R2i，對比分析表明這兩組控制系數(shù)的變化規(guī)律基本一致，表明螺旋藻β-胡蘿卜素合成途徑中番茄紅素-β-環(huán)化酶(LYC-B，CpLYC-B=0.161，R2LYC-B=0.2601)、RuBP羧化酶(RuBisCO，CpRuBisCO=0.121，R2RuBisCO=0.2453)、磷酸甘油酸變位酶(PGM，CpPGM=0.163，R2PGM=0.2320)、丙酮酸脫氫酶(PDHC，CpPDHC=0.119，R2PDHC=0.1584)和異檸檬酸脫氫酶(ICDH，CpICDH=0.172，R2ICDH= 0.1935)5種酶對β-胡蘿卜素的代謝通量的分布或改變起主要控制作用。這兩種方法簡便易行，簡化了實驗操作和計算過程，可為代謝工程育種及代謝控制分析提供新方法。

數(shù)量遺傳學；代謝控制分析；主成分分析；通徑分析；β-胡蘿卜素

代謝控制分析理論(MCT)最初是由Higgins[1]提出經(jīng)Kacser等[2]和Balley[3]發(fā)展和完善起來的，Heinrich等[4]首先提出為了解每步反應(yīng)對整個代謝流的控制需測定途徑中每一步酶反應(yīng)。20世紀90年代初，隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，修飾和重構(gòu)代謝網(wǎng)絡(luò)得以實現(xiàn)，此后代謝控制分析(MCA)也逐步完善并得到廣泛應(yīng)用，認為代謝通量受途徑中關(guān)鍵步驟的關(guān)鍵酶調(diào)控的傳統(tǒng)代謝調(diào)控觀點已經(jīng)徹底被摒棄?，F(xiàn)代代謝控制分析理論認為代謝系統(tǒng)中所有反應(yīng)步驟都直接或者間接地對代謝通量和代謝物濃度產(chǎn)生影響，其基本研究對象是由代謝反應(yīng)序列和代謝途徑組成的代謝系統(tǒng)，其中單步反應(yīng)是組成系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)單元。MCA可以在代謝系統(tǒng)發(fā)生酶活性的擾動時準確地量化每一種酶對代謝通量的控制作用，廣泛應(yīng)用在基因工程育種和途徑分析中。然而獲得酶活性的擾動往往需要借助基因操作，通量控制系數(shù)(FCC)的計算也過于復(fù)雜，這些局限性很大程度限制了MCA的發(fā)展和應(yīng)用。因此，簡化代謝控制分析，探索更加簡單易行的分析方法已成為代謝工程育種工作中亟待解決的難題。

代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是由代謝途徑中所有酶和代謝物質(zhì)所構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，而相關(guān)分析、主成分分析和通徑分析等多元統(tǒng)計分析方法是研究復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的有力工具[5]。為了尋求代謝控制分析的新方法并簡化通量控制系數(shù)的計算過程，本實驗引入統(tǒng)計學分析方法研究螺旋藻β-胡蘿卜素合成途徑中主要的酶對β-胡蘿卜素代謝通量的控制作用，并嘗試結(jié)合相關(guān)分析建立基于主成分分析和通徑分析的符合統(tǒng)計學原理的控制系數(shù)，以期對代謝控制分析進行簡化。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

本實驗選取6株螺旋藻(代號分別為：438、834、791、971、nm和gg)，其中前4株為引進品種，后兩株由本課題組篩選保藏。

AB液體培養(yǎng)基(g/L)：NaHCO313.61、Na2CO34.03、KH2PO40.5g、NaNO32.5、K2SO41、NaCl 1、MgSO4·7H2O 0.2、CaCl2·2H2O 0.04、PIV 6mL，A51mL。

其中A5(mg/100mL)：H3BO3286、MnCl2·4H2O 181、ZnSO4·7H2O 22、MnSO4·7H2O 250、CuSO4·5H2O 7.4、Na2MoO42.1；PIV(mg/L)：Na2EDTA 750、FeCl3·7H2O 97、MnCl2·4H2O 41、ZnCl25、CoCl2·6H2O 2、Na2MoO4·2H2O 4。將配制好的培養(yǎng)基分裝后，121℃滅菌30min。

β-胡蘿卜素標準品 美國Fluca公司；三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、二乙胺基乙基纖維素(DEAE)、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸烯醇丙酮酸、2,3-二磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸、2-磷酸甘油酸、3-磷酸甘油醛、6-磷酸果糖、1,6-二磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、醛縮酶、丙酮酸 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPG-280BX光照培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；3K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司；752型紫外-可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；VCX 105超聲波細胞粉碎機 美國Sonic&Materis公司；Fluoroskan Ascent FL熒光-化學發(fā)光檢測儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 螺旋藻培養(yǎng)

將6株活化好的藻種按OD560nm=0.150分別接入裝有AB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每個品種接種3個平行，隨機擺放在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6～8d，培養(yǎng)溫度為33℃，光照度為5000lx。

1.3.2 凈光合速率的測定

凈光合速率的測定采用黑白瓶法。將1.3.1節(jié)處理后的藻體(2g)分別放入500mL的黑白瓶中，采用虹吸的方法充滿AB培養(yǎng)基，把所有的空氣趕出后，將白瓶和黑瓶密閉，在不同溫度(22、25、30、33、35、37、40℃)，光照度為5000lx的條件下生長2h，用碘量法[6]分別測定光合作用前后黑白瓶中溶解氧的濃度。根據(jù)溶解氧濃度的變化、光合作用時間及藻體的鮮質(zhì)量即可求出螺旋藻的凈光合速率。

1.3.3 β-胡蘿卜素代謝通量分析

圖1 螺旋藻β-胡蘿卜素的代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Metabolic network of β-carotene in Spirulina

表1 螺旋藻的代謝反應(yīng)Table 1 Metabolic reaction of Spirulian

表2 螺旋藻生長的前體需求系數(shù)Table 2 Precursor requirement coefficients for Spirulina

表3 螺旋藻代謝通量模型方程式Table 3 Metabolic flux model equation of Spirulina

從圖1可知，所選取的代謝網(wǎng)絡(luò)共有10個中間代謝物，2個代謝產(chǎn)物，若以一個總的方程式表示細胞生長過程，各前體物質(zhì)及其需求系數(shù)[8]見表2，其反應(yīng)速率用rx表示[9]，共可構(gòu)建13個方程，平衡方程為10個(表3)，因此系統(tǒng)的自由度df =13-10=3，通過實驗可以測定的值有：藻體比生長速率、凈光合速率和β-胡蘿卜素比生成速率。因此，已知速率為3，此方程可以得到唯一解。

1.3.4 酶活性測定

粗酶液制備：藻液OD560nm達到0.8左右時取樣，冰浴下迅速冷卻，然后于4℃、2000r/min離心5min。棄去上清液，沉淀用PBS洗滌2～3次后用酶抽提液(pH7.4 100mmol/L HEPES緩沖液，10mmol/L KCl、0.5mmol/L二硫蘇糖醇、0.2%曲拉通-100)溶解，冰浴下用超聲波細胞破碎儀破碎(至鏡檢細胞完全破碎)后，取上清液即粗酶液。

酶活性測定方法：本實驗測定螺旋藻中β-胡蘿卜素合成代謝途徑11種相關(guān)酶的活性：RuBP羧化酶(RuBisCO)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸甘油酸變位酶(PGM)、丙酮酸激酶(PK)、丙酮酸脫氫酶(PDHC)、異檸檬酸脫氫酶(ICDH)和α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)活性的測定參考文獻[10-12]，番茄紅素-β-環(huán)化酶(LYC-B) 活性的測定參考文獻[13]。

1.3.5 多元統(tǒng)計分析方法

相關(guān)性分析，主成分分析[14]和通徑分析[15]多元統(tǒng)計分析用SPSS 16.0 for Windows軟件實現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素代謝通量分析及其與11種酶活性的相關(guān)性分析

分別測定了供試藻對數(shù)生長期的比生長速率、凈光合速率和β-胡蘿卜素比生成速率，結(jié)果見表4。將表4中的數(shù)據(jù)代入平衡方程(表3)，用Matlab7.0求解即可求出β-胡蘿卜素的代謝通量。

表4 供試藻的生理參數(shù)和β-胡蘿卜素的代謝通量Table 4 Physiological parameters and β-carotene metabolic flux of tested Spirulina

2.2 11種酶的活性及其與代謝通量的相關(guān)性分析

分別測定6株螺旋藻β-胡蘿卜素合成途徑中11種相關(guān)酶的活性，并對11種酶活性與β-胡蘿卜素代謝通量作相關(guān)分析，用SPSS 16.0 for Windows軟件包輸出分析結(jié)果見表5。

從表5可知，各種酶之間以及各種酶與代謝通量之間均存在不同程度的相關(guān)性，有些達到顯著或極顯著水平，這表明β-胡蘿卜素合成途徑中的每一種酶都影響代謝通量，而且各種酶之間的相互作用比較明顯，這符合代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控觀點。相關(guān)分析直觀地反映了代謝網(wǎng)絡(luò)的特征，同時也可看到各種酶與代謝通量的關(guān)系十分復(fù)雜，還需要作更深入的分析以了解酶對代謝通量的控制作用。

2.3 基于主成分分析的代謝控制分析

經(jīng)KMO檢驗和Bartlett球度檢驗，11種酶活性數(shù)據(jù)適合因子分析。用SPSS 16.0 for Windows對11種酶的活性進行主成分分析，結(jié)果見圖2。

圖2 酶活性主成分三維坐標分布圖Fig.2 Distribution of principal components in three-dimensional coordinate of enzyme activities

通過分析提取3個主成分(圖2、表3)，累積貢獻率達到了92.564%，其中第一主成分貢獻率為39.635%，主要反映了磷酸果糖激酶(PFK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸甘油酸變位酶(PGM)、丙酮酸脫氫酶(PDHC)和α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)，這些酶大都是線性途徑中的酶，這些酶對β-胡蘿卜素代謝通量的控制作用最顯著；第二主成分貢獻率28.137%，主要反映了RuBP羧化酶(RuBisCO)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和己糖激酶(HK)，這幾種酶主要集中在代謝網(wǎng)絡(luò)(圖1)第一個節(jié)點三磷酸甘油醛(G3P)附近，這是一個柔韌性較強的節(jié)點，這個節(jié)點的下行(PEP方向)流量直接影響β-胡蘿卜素的代謝通量；第三主成分貢獻率24.792%，主要反映了異檸檬酸脫氫酶(ICDH)和番茄紅素-β-環(huán)化酶(LYC-B)，這兩種酶位于乙酰輔酶A的兩個分支上，這也是一個柔性節(jié)點，LYC-B的活性直接決定β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

表5 各種酶之間的相關(guān)系數(shù)Table 5 Person correlation coefficients between enzyme activities

表6 主成分載荷矩陣Table 6 Principal component matrix

用表6中的數(shù)據(jù)除以主成分相對應(yīng)的特征值開平方根便得到3個主成分中每個指標所對應(yīng)的系數(shù)(表7)。以每個主成分所對應(yīng)的特征值占所提取主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重計算綜合主成分中每個指標所對應(yīng)的系數(shù)。該系數(shù)綜合反應(yīng)了每種酶對代謝通量的控制作用，將其歸一化后的數(shù)值記為Cpi。從表7可知，異檸檬酸脫氫酶(ICDH，CpICDH=0.172)，磷酸甘油酸變位酶(PGM，CpPGM=0.163)，番茄紅素-β-環(huán)化酶(LYC-B，CpLYC-B=0.161)，RuBP羧化酶(RuBisCO，CpRuBisCO=0.121)和丙酮酸脫氫酶(PDHC，CpPDHC=0.119)對β-胡蘿卜素代謝通量起主要控制作用，其中以ICDH的控制作用最強；而丙酮酸激酶(PK，CpPK=-0.012)和磷酸甘油酸激酶(PGK，CpPGK=-0.026) 對β-胡蘿卜素代謝通量具有一定的控制作用。

表7 主成分表達式矩陣系數(shù)和基于主成分分析的控制系數(shù)Table 7 Principal component expression coefficient matrix and control coefficient based on principal component analysis

2.4 基于通徑分析的代謝控制分析

在相關(guān)分析的基礎(chǔ)上對11種酶進行通徑分析。通徑分析能全面了解多變量間的相互關(guān)系，包括作用方式及其影響程度，將簡單相關(guān)系數(shù)代入正規(guī)方程即可求解出通徑系數(shù)(P)[16-17](表8)。

通徑分析結(jié)果(表8，圖3)顯示，11種酶活性對β-胡蘿卜素通量的相對重要性依次為：番茄紅素-β-環(huán)化酶(LYC-B，Py.11=0.3426)＞RuBP羧化酶(RuBisCO，Py.1= 0.3151)＞異檸檬酸脫氫酶(ICDH，Py.9=0.2744)＞磷酸甘油酸變位酶(PGM，Py.6=0.2414)＞丙酮酸脫氫酶(PDHC，Py.8=0.1425)＞磷酸果糖激酶(PFK，Py.4=0.1123)＞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD，Py.2=0.0884)＞己糖激酶(HK，Py.3=0.0681)＞α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC，Py.10= -0.0147)＞丙酮酸激酶(PK，Py.7=-0.1242)＞磷酸甘油酸激酶(PGK，Py.5=-0.1352)，這個通徑系統(tǒng)的相關(guān)指數(shù)R2=0.8854，說明這10種酶決定了β-胡蘿卜素通量88.54%的變異，剩下11.46%的變異歸屬于其他未知因素和實驗誤差。直接影響較大的幾種酶LYC-B、RuBisCO、ICDH、PGM與β-胡蘿卜素代謝通量的相關(guān)系數(shù)也較大，說明這幾種酶對β-胡蘿卜素代謝通量起主要控制作用；α-KGDHC、PK和PGK對代謝通量具有一定的負效應(yīng)，尤以后兩者較為明顯。

圖3 11種酶通徑圖譜Fig.3 Path diagram of 11 enzymes

通徑分析還能清晰地反映出某種酶通過其他酶對代謝通量產(chǎn)生的間接影響，用Pxi→xj→y表示第i種酶通過第j種酶對通量的間接效應(yīng)，表8列出了這些間接作用。其中以Px1→x6→y= 0.2352，Px8→x11→y= 0.2315，Px11→x4→y= 0.1841等較為明顯，也有一些酶的間接效應(yīng)為負，例如：Px8→x11→y=-0.2315，Px6→x4→y=-0.1655，Px3→x10→y= -0.1586等。

表8 通徑分析結(jié)果Table 8 Result of path analysis

表9 11種酶的決定系數(shù)Table 9 Determination coefficients of 11 enzymes

上述通徑分析精細地反映了各種酶對代謝通量的直接和間接影響，為考察酶對通量的綜合控制作用將xi對y的控制系數(shù)R2i[16]定義為：

式中：R2i為直接決定系數(shù)；R2ij=2Py.irijPy.j為間接決定系數(shù)。

R2i反映了xi通過x1、x2、xp的相關(guān)網(wǎng)對y的綜合決定作用，它不僅包含了xi對y的直接決定作用R2i，還包含了與xi有關(guān)的間接決定系數(shù)∑R2ij。由式(1)可計算出11種酶的決定系數(shù)，結(jié)果見表9。

表9顯示，螺旋藻β-胡蘿卜素合成途徑中，番茄紅素-β-環(huán)化酶(LYC-B，R2LYC-B=0.2601)、RuBP羧化酶(RuBisCO，R2RuBisCO=0.0424)、磷酸甘油酸變位酶(PGM，R2PGM=0.2112)、丙酮酸脫氫酶(PDHC，R2PDHC=0.1484)和異檸檬酸脫氫酶(ICDH，R2ICDH=0.1865)對β-胡蘿卜素代謝通量具有相對較高的決定系數(shù)，說明這5種酶對β-胡蘿卜素通量起主要控制作用；己糖激酶(HK，R2HK= 0.0643)，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD，R2G6PD=0.0424)和磷酸果糖激酶(PFK，R2PFK=0.0214)的決定系數(shù)相對較低，均不到0.1，說明它們對β-胡蘿卜素通量的影響很小；而磷酸甘油酸激酶(PGK，R2PGK= -0.0653)，丙酮酸激酶(PK，R2PK= -0.0792)和α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC，R2α-KGDHC=-0.0152)的決定系數(shù)為負值，說明對β-胡蘿卜素通量具有較為明顯的控制作用。

2.5 兩種方法分析結(jié)果的比較

圖4 兩組控制系數(shù)對比圖Fig.4 Comparative plots of control coefficients from both groups

分別建立了基于主成分分析和通徑分析的代謝控制系數(shù)，為考察基于數(shù)量遺傳學方法建立的兩組控制系數(shù)是否能真實地反映β-胡蘿卜素合成途徑中11種酶對其代謝通量的控制作用，將這兩組數(shù)據(jù)進行了對比分析。

如圖4所示，兩組控制系數(shù)具有良好的相關(guān)性，所反映的酶控制代謝通量規(guī)律的一致性較好， LYC-B、RuBisCO、PGM、ICDH和PDHC 5種酶對β-胡蘿卜素的代謝通量起著主要控制作用；HK、G6PD等酶的控制作用較??；PGK和PK對通量均具有一定的負控制作用。α-KGDHC的控制系數(shù)出現(xiàn)不一致的，這可能是由于統(tǒng)計樣本偏小和實驗誤差所致?？傮w來說這兩組基于數(shù)量遺傳學方法建立的控制系數(shù)很好地反映了β-胡蘿卜素合成途徑中11種酶對其代謝通量的調(diào)控規(guī)律，而且所需的實驗操作簡單易行，控制系數(shù)的計算過程符合統(tǒng)計學原理，達到了簡化代謝控制分析的目的。

3 結(jié) 論

本研究引入多元統(tǒng)計學方法建立并計算了基于主成分分析的控制系數(shù)Cpi和基于通徑分析的控制系數(shù)R2i，這兩組控制系數(shù)的對比分析表明它們具有較好的一致性，均反映出LYC-B、RuBisCO、PGM、ICDH和PDHC 5種酶對β-胡蘿卜素的代謝通量起著主要控制作用，提高這些酶的活性將可很大程度提高β-胡蘿卜素的通量；PGK和PK對β-胡蘿卜素的代謝通量均具有一定的負控制作用，如果螺旋藻中這兩種酶的活性較高，將抑制β-胡蘿卜素的生物合成，從而降低其通量。清楚地了解螺旋藻β-胡蘿卜素合成途徑中各種酶對其代謝通量的控制作用，對螺旋藻β-胡蘿卜素的途徑分析、基因工程育種工作和代謝工程生產(chǎn)實踐都具有一定的借鑒和指導(dǎo)意義。而且，這兩種方法很大程度地簡化了基于酶活性擾動的代謝控制分析，簡便易行。

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Metabolic Control Analysis of β-Carotene in Spirulina

WANG Fang，PANG Guang-chang*，WANG Jing-chuan
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Two problems of metabolic control analysis are the acquisition of enzyme activity distribution and the calculation of flux control coefficient (FCC), which often needs gene manipulation and complicated calculation. A large number studies indicated that both quantitative trait loci (QTL) effect and flux control coefficient revealed similar L-shaped distribution. Therefore, metabolic flux of β-carotene in Spirulina was considered as a quantitative trait. Principal component analysis and path analysis were used to explore the control effects of enzymes on metabolic flux for the first time. The control coefficients based on principal component analysis (Cpi) and path analysis (R2i) were established after correlation analysis between enzymes and metabolic flux. Comparative analysis results indicated control coefficients from both groups had a consistent change trend. Therefore, five enzymes including lycopene β-cyclase (LYC-B, CpLYC-B= 0.161, R2LYC-B= 0.2601), ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (RuBisCO, CpRuBisCO= 0.121, R2RuBisCO= 0.2453), phosphoglyceromutase (PGM, CpPGM= 0.163, R2PGM= 0.2320), pyruvate dehydrogenase (PDHC, CpPDHC = 0.119, R2PDHC = 0.1584) and isocitrate dehydrogenase (ICDH, CpICDH = 0.172, R2ICDH = 0.1935) played an important role in the flux of β-carotene. The two established methods in this study are simple and accurate so that these methods with simplified operation and calculation process will provide new strategies for metabolic engineering breeding and metabolic control analysis.

quantitative genetics； metabolic control analysis； principal component analysis； path analysis；βcarotene

Q591

A

1002-6630(2011)07-0237-07

2010-05-27

天津市重點科技攻關(guān)專項(06YFGZNC04200)

王芳(1984—)，女，碩士研究生，主要從事代謝工程和食品免疫學研究。E-mail：wangfang841208@163.com

*通信作者：龐廣昌(1956—)，男，教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)及食品免疫學研究。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn