黃衛(wèi)文，黎繼烈，戴梓茹，李忠海

(1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院，湖南 長沙410004；3.欽州學院化學化工學院，廣西 欽州 535000)

花生根細胞懸浮培養(yǎng)制備白藜蘆醇條件的優(yōu)化

黃衛(wèi)文1，黎繼烈2，戴梓茹3，李忠海1

(1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院，湖南 長沙410004；3.欽州學院化學化工學院，廣西 欽州 535000)

以花生根愈傷組織為材料，采用二次通用旋轉組合試驗設計，優(yōu)化花生根細胞懸浮培養(yǎng)產白藜蘆醇的條件，探討影響花生根細胞懸浮培養(yǎng)產白藜蘆醇的最佳工藝參數(shù)。當搖床轉速為130r/min、接種量為38.00g/L、pH5.80、蔗糖質量濃度為40.00g/L時，培養(yǎng)15d，花生根細胞增殖倍數(shù)最大為(4.71±0.04)倍，白藜蘆醇產量達到907.3μg/g。

花生根細胞；愈傷組織；懸浮培養(yǎng)；白藜蘆醇

白藜蘆醇為非黃酮類多酚化合物，是一種低毒的天然藥物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、預防心臟病、抗癌、抗血小板凝聚、保護肝臟、免疫調節(jié)、防輻射、雌激素樣作用、抗艾滋活性等優(yōu)良的藥理活性和保健功能[1-6]。廣泛應用于食品、醫(yī)藥、保健品、化妝品、食品添加劑等領域。白藜蘆醇在植物中以游離態(tài)或結合態(tài)存在，主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑葚、朝鮮槐等植物中[7]，但其在植物體內的含量普遍很低，即使應用一些環(huán)境誘導因素，如生物因素[8-10]和非生物因素[11-12]來提高白藜蘆醇的含量，其效果也很有限。從天然植物中獲取白藜蘆醇面臨著資源短缺的問題，尋找獲取更多白藜蘆醇的有效途徑成為研究熱點。植物細胞懸浮培養(yǎng)技術為利用植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產有用次生代謝產物提供了有效途徑與方法[13]?；ㄉ仓?尤其是根部)為白藜蘆醇含量較高的植物[14-15]，Medina-Bolivar等[16]從花生的毛狀根組織培養(yǎng)液中檢測到較高含量的白藜蘆醇及其衍生物。本實驗以花生植株(根部)為原料，通過二次回歸通用旋轉組合試驗，建立花 生根細胞懸浮培養(yǎng)的回歸模型方程，優(yōu)化細胞懸浮培養(yǎng)的條件，為花生根細胞懸浮培養(yǎng)制備白藜蘆醇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

花生植株：分別選取廣西玉林桂花、遼寧沈陽黑花、遼寧沈陽海花、湖南長沙紅星等花生植株為外植體，進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，并測定各愈傷組織中的白藜蘆醇含量，選用白藜蘆醇含量較高、開花后第40天的桂花根尖部分為實驗材料。

磷酸、疏基乙醇、硼酸、聚乙烯吡咯烷酮、苯丙氨酸、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫為食品級或分析純。

UV-1700紫外分光光度計、UV-PROBE操作系統(tǒng) 日本島津公司；VCX500超聲波細胞粉碎儀 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

愈傷組織誘導培養(yǎng)基：以MS為基礎培養(yǎng)基，附加30.00g/L蔗糖、9.00g/L瓊脂、2.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、 1.8mg/L 6-糠氨基嘌呤(KT)、3.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)。將培養(yǎng)基的pH值調至5.80，分裝，于121℃、0.15MPa滅菌20min，冷卻備用。

細胞懸浮種子培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基中添加2.5mg/L 2,4-D、1.8mg/L KT、3.0mg/L 6-BA、30.00g/L蔗糖，pH值調至5.80，加熱，煮沸后分裝于50mL三角瓶中，每瓶裝20mL液體培養(yǎng)基，于121℃、0.15MPa滅菌20min，冷卻備用。

1.2.2 愈傷組織誘導與細胞懸浮種子培養(yǎng)

選取健壯無病、品種為桂花的花生植株根部，沖洗干凈，晾干表面水分，在超凈工作臺內用75%乙醇消毒30s，無菌水沖洗3次， 0.1% HgCl2消毒9min，無菌水沖洗6次，置于無菌濾紙上晾干，切成約1cm長的小段，接入1.2.1節(jié)愈傷組織誘導培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，以不同濃度的激素對花生根愈傷組織誘導率的影響進行實驗，確定最佳激素配比，并以此為基礎配制花生根細胞懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基[17]。培養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃，光照時間12h/d，每21d 繼代一次。

將經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)獲得的花生根愈傷組織接種到1.2.1節(jié)細胞懸浮種子培養(yǎng)基中，接種量約為35.00g/L，置于搖床進行振蕩培養(yǎng)，搖床轉速為125r/min。培養(yǎng)過程中除去大的組織塊和細胞團，獲得生長均勻的細胞，以此作為懸浮培養(yǎng)種子細胞。

1.2.3 四元二次回歸通用旋轉組合試驗設計

植物細胞懸浮培養(yǎng)的增殖受多種因素的影響，根據(jù)預實驗對搖床轉速、接種量、pH值、蔗糖質量濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、液料比的單因素試驗及其他試驗條件的綜合考察，本實驗選擇搖床轉速(X1)、接種量(X2)、pH值(X3)、蔗糖質量濃度(X4)4個因素，以花生根細胞的增殖倍數(shù)(Y)為指標，通過四元二次回歸通用旋轉組合試驗，建立數(shù)學回歸方程模型，經(jīng)過回歸分析和方差分析，對數(shù)學模型進行檢驗尋優(yōu)，確定懸浮培養(yǎng)體系的優(yōu)化條件[18]。各因素編碼和水平見表1。

表1 四元二次通用旋轉組合試驗因素水平表Table 1 Factor and levels in quadratic rotation combinatorial design

1.2.4 花生根細胞增殖倍數(shù)測定

式中：n為接種量/(g/L)；ρ為收獲的細胞質量濃度/ (g/L)。

花生根懸浮細胞干質量及白藜蘆醇含量的測定參照文獻[17]的方法。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)，采用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件進行分析，并利用Statistica 6.0軟件繪出3D曲面圖，分析各因素對花生根細胞懸浮培養(yǎng)體系細胞增殖的影響。

2 結果與分析

2.1 四元二次通用旋轉組合試驗結果

表2 四元二次通用旋轉組合試驗結果Table 2 Quadratic rotation combinatorial design scheme and experimental results

對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，建立以花生根懸浮培養(yǎng)細胞的增殖倍數(shù)為目標函數(shù)的二次回歸數(shù)學模型：

Y=3.946＋0.311X1＋0.298X2＋0.389X3＋0.153X4-0.044X1X2-0.173X1X3＋0.099X1X4- 0.136X2X3＋0.022X2X4＋0.056X3X4-0.143X12-0.142X22-0.175X32＋0.066X42

檢驗回歸模型擬合度及其顯著性，試驗所得回歸模型擬合度較好，R2=0.9025，表明回歸模型較好地擬合了花生根懸浮培養(yǎng)細胞的增殖倍數(shù)與各因素之間的關系，模型得出的結果可靠。在顯著性方面，P＜0.001，達到極顯著水平。同時對回歸模型方程中各項進行方差分析，所得結果如表3所示。

表3 回歸模型各項方差分析Table 3 Variance analysis of polynomial regression model

根據(jù)表3回歸模型方程中各項方差分析結果，剔除不顯著項，得到以細胞增殖倍數(shù)為目標函數(shù)的二次回歸數(shù)學模型：

由回歸方程中各因素系數(shù)絕對值可知，4個因素中對細胞增殖倍數(shù)的影響順序為pH值＞搖床轉速＞接種量＞蔗糖質量濃度。

2.2 單因素效應分析

對單因素效應方程進行規(guī)劃求解，得到花生根懸浮細胞增殖倍數(shù)的理論最大值和各因素的水平取值。搖床轉速為142r/min、接種量為37.87g/L、pH值為5.82與蔗糖質量濃度為40.00g/L時，各自的增殖倍數(shù)達到最大，分別為4.11、4.10、4.16和4.25。如圖1所示，細胞增殖倍數(shù)與搖床轉速、接種量及pH值之間呈拋物線關系，隨著各因素水平增加，花生根細胞增殖倍數(shù)表現(xiàn)為先增加后下降的趨勢；花生根細胞增殖倍數(shù)與蔗糖質量濃度之間呈線性關系，隨著蔗糖質量濃度水平的增加，花生根細胞增殖倍數(shù)也增加。

圖1 單因素效應曲線Fig.1 Single factor-effect curves

2.3 各因素交互作用響應曲面模型分析

固定搖床轉速、接種量、pH值和蔗糖質量濃度4個因素中的2個因素在0水平編碼，代入簡化回歸模型方程，考察其他兩個因素對花生根懸浮培養(yǎng)細胞增殖倍數(shù)的影響，繪出3D曲面圖，結果圖2所示。

圖2 各因素交互作用響應曲面圖Fig.2 Response surface plots for the interactive effects of four factors on proliferation fold of suspension cells

在試驗范圍內，隨著各因素水平的變動，增殖倍數(shù)的變化范圍較大(＞1.9倍)，說明交互作用對增殖倍數(shù)影響較大，交互作用明顯。當搖床轉速編碼值在-0.700～1.600、接種量編碼值在0.400～1.700、pH值編碼值在-0.500～2.000范圍，蔗糖質量濃度編碼值在2.000時，有利于細胞增殖倍數(shù)的提高，增殖倍數(shù)可達到4.66倍以上。各因素對提取效率均有影響，其中pH值和搖床轉速對增殖倍數(shù)的影響效果最為顯著。

2.4 模型尋優(yōu)與驗證實驗

從2.3節(jié)響應面分析可知，響應值有最大值，X1、X2、X3、X4存在極值點，所以對模型進行響應因素的水平優(yōu)化分析，得到4個因素的最優(yōu)試驗點(X1，X2，X3，X4)的代碼值為(0.592，1.049，0.819，2.000)，其相應真實值為(132，37.90，5.76，40.00)，此時響應值的最大值是4.66倍。為方便操作，真實值可以分別取值(130，38.00，5.80，40.00)。

為了檢驗模型預測的準確性，分別取搖床轉速130r/min，接種量38.00g/L，pH5.80，蔗糖質量濃度40.00g/L，培養(yǎng)15d，進行驗證實驗，實驗重復5次，得到實驗值為(4.71±0.04)倍，與理論值4.66倍基本一致，而且干質量的花生根細胞中白藜蘆醇產量達到907.3μg/g，與自然生長的花生根(白藜蘆醇含量94.3μg/g)[9]相比，白藜蘆醇產量顯著提高，由此表明建立的模型可靠。

3 結論與討論

不同的植物細胞在培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)條件及所需要的營養(yǎng)物質并不完全相同。本實驗培養(yǎng)15d便可達到最大生物量，收獲的細胞呈淡黃色，沒有出現(xiàn)褐化或受到損傷等現(xiàn)象。說明在培養(yǎng)過程中，搖床轉速所產生的溶氧能滿足細胞的生長，而產生的剪切力沒有對細胞造成傷害；接種量不僅能啟動細胞的生長，且對營養(yǎng)物質的消耗適宜；pH值為5.80時，細胞增殖倍數(shù)最大，這可能是因為pH值影響培養(yǎng)細胞膜透性或代謝所致，其機理有待進一步研究；蔗糖質量濃度為40.00g/L時能夠滿足細胞的生長，且對細胞的生長和白藜蘆醇的合成沒有抑制作用，這說明花生根細胞能夠耐受較高濃度的糖。

實驗各因素對花生根細胞懸浮培養(yǎng)的細胞增殖倍數(shù)的影響順序為pH值＞搖床轉速＞接種量＞蔗糖質量濃度。當搖床轉速130r/min、接種量38.00g/L、pH5.80、蔗糖質量濃度40.00g/L時，培養(yǎng)15d，細胞增殖倍數(shù)達到(4.71±0.04)倍，干質量的花生根細胞中白藜蘆醇產量達到907.3μg/g，建立的模型理論值與實驗值相符，回歸模型可靠，所優(yōu)化的培養(yǎng)條件可明顯提高花生根懸浮培養(yǎng)細胞中的白藜蘆醇含量。

[1] 黨尉, 尉亞輝, 曹煒. 白藜蘆醇合酶的研究進展[J]. 植物學通報, 2003, 20(2): 152-159.

[2] MERTENS-TALCOTT S U, PERCIVAL S S. Ellagic acid and quartering interact synergistically with resveratrol in the induction of apoptosis and cause transient cell cycle arrest in human leukemia cells[J]. Cancer Lett, 2005, 218(2): 141-151.

[3] SIGNORELLI P, GHIDONI R. Resveratrol as an anticancer nutrient molecular basis, openqustions and promises[J]. Journal of Nutrient Biochemical, 2005, 16(8): 449-466.

[4] JUNG H J, HWANG I A, SUNG W S, et al. Fungicidal effect of resveratrol on human infectious fungi[J]. Arch Pharm Res, 2005, 28(5): 557-560.

[5] GEHM B D, MCANDREWS J M, CHIEN P Y, et al. Resveratrol, a polyphenolic compound found in grapes and wine, is an agonist for the estrogen receptor[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(25): 14138-14143.

[6] NAKAGAWA H, KIYOZUKA Y, UEMURA Y, et al. Resveratrol inhibits human breast cancer cell growth and may mitigate the effect of linoleic acid, a potent breast cancer cell stimulator[J]. Cancer Res Clin Oncol, 2001, 127(4): 258-264.

[7] 張宏芳, 張秀琦, 鄭建斌, 等. 葡萄酒中白藜蘆醇的二次微分簡易示波伏安法測定[J]. 分析測試學報, 2001, 20(2): 21-23.

[8] YEN G C, DUH P D, TSAI C L. Relationship between antioxidant activity and maturity of peanut hulls[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1993, 41(1): 67-70.

[9] SOBOLEV V S, COLE R J, DOMER J W. Isolation, purification, and liquid chromatographic determination of stilbene phytoalexins in peanuts [J]. Journal of AOAC International, 1995, 78(5): 1177-1182.

[10] AGUAMAH G E, LANGCAKE P, LEWORTHY D P. Two novel stilbene phytoalexins from arachis hypogaea[J]. Phytochemistry, 1981, 20(6): 1381-1383.

[11] RAO P V S, WADIA K D R, STRANGE R N. Biotic and abiotic elicitation of phytoalexins in leaves of groundnut (Arachis hypogaea L.) [J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1996, 49(5): 343-357.

[12] ARORA M K, STAGE R N. Phytoalexin accumulation in groundnuts in response to wounding[J]. Plant Science, 1991, 78(2): 157-160.

[13] VERPOORTE R, VARDER R, SCHRIPSEMA J. Plant cell biotechnology for the production of alkaloids: present status and prospect[J]. J Natural Product, 1993, 56 (2): 186-207.

[14] CHEN R S, WU P L, CHIOU R Y Y. Peanut roots as a source of resveratrol[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(6): 1665-1667.

[15] 王琴飛, 李景明, 張如蓮. 花生中白藜蘆醇及其衍生物的研究進展[J]. 中國糧油學報, 2009, 24(10): 145-152.

[16] MEDINA-BOLIVAR F, CONDORI J, RIMANDO A M, et al. Production and secretion of resveratrol in hairy root culture of peanut[J]. Phytochemistry, 2007, 68(14): 1992-2003.

[17] 黃衛(wèi)文, 李忠海. 花生細胞懸浮培養(yǎng)物中白藜蘆醇的積累調控與分離純化[D]. 長沙: 中南林業(yè)科技大學, 2010.

[18] 劉建峰, 葛向陽, 梁運祥. 響應面法優(yōu)化豆粕固態(tài)發(fā)酵工藝的研究[J]. 中國生物工程雜志, 2007, 27(6): 87-91.

Optimization of Suspension Culture Conditions for Preparing Resveratrol in Peanut Root Cells

HUANG Wei-wen1，LI Ji-lie2，DAI Zi-ru3， LI Zhong-hai1
(1. College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China；2. College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China；3. College of Chemistry and Chemical Engineering, Qinzhou University, Qinzhou 535000, China)

Quadratic rotation combinatorial design was utilized to optimize suspension culture conditions for resveratrol production by peanut root callus tissue. Under the following optimized conditions: shaker rational speed 130 r/min; inoculum size 38.00 g/L; pH 5.80; and sucrose concentration 40.00 g/L, the maximum proliferation fold of suspension cells was 4.71 ± 0.04, and the resveratrol production reached 907.3 μg/g after 15-day incubation.

peanut root cell；callus；suspension culture；resveratrol

Q813

A

1002-6630(2011)07-0233-04

2010-06-05

湖南省教育廳科技項目(05C335)

黃衛(wèi)文(1956—)，男，高級實驗師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：hww5626@163.com