傅明亮，劉曉杰，劉 婧，何國慶，陳啟和*

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶純化和性質(zhì)研究

傅明亮，劉曉杰，劉 婧，何國慶，陳啟和*

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

用地衣芽孢桿菌發(fā)酵液制備彈性蛋白酶粗酶液，采用硫酸銨分級(jí)沉淀和Sephadex凝膠柱層析的方法分離純化彈性蛋白酶，并對(duì)彈性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：彈性蛋白酶粗酶液經(jīng)40%～70%飽和度的硫酸銨純化后比活力提高到120U/mg，經(jīng)凝膠柱層析純化后比活力可達(dá)到292U/mg，純化倍數(shù)為12.6，SDS-PAGE法證實(shí)彈性蛋白酶分子質(zhì)量為29.5kD。對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果表明：彈性蛋白酶最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH值為7.4，以剛果紅-彈性蛋白為底物，米氏常數(shù)Km為9.67mg/mL。低濃度金屬離子Ca2+和K+對(duì)酶活力有促進(jìn)作用，而Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+對(duì)酶活力則有抑制作用。

地衣芽孢桿菌ZJUEL31410；彈性蛋白酶；純化；酶學(xué)性質(zhì)

彈性蛋白酶(EC 3.4.4.7，elastase)，是一種以水解不溶性彈性蛋白為特征的蛋白水解酶，可作為治療高血脂癥、防止動(dòng)脈粥樣硬化的生化藥物[1]。蘭辛[2]研究發(fā)現(xiàn)，彈性蛋白酶能有效抑制用高脂高營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)小鼠的血清和膽固醇的升高，降低體內(nèi)甘油三酯(TG)和丙二醛含量(MDA)。此外，由于彈性蛋白酶能夠?qū)Ｒ唤到饨Y(jié)締組織中堅(jiān)韌的彈性纖維組分，當(dāng)其他蛋白與彈性蛋白共存時(shí)，此酶優(yōu)先對(duì)彈性蛋白水解，因此彈性蛋白酶可以作為理想的肉類嫩化劑用于食品加工業(yè)[3]。

彈性蛋白酶可由動(dòng)物胰臟提取或由微生物發(fā)酵制得，我國彈性蛋白酶的生產(chǎn)主要從豬胰臟提取，但由于臟器資源利用受限制，彈性蛋白酶向來供不應(yīng)求，因此研究者都轉(zhuǎn)向微生物發(fā)酵法制備彈性蛋白酶[4]。微生物彈性蛋白酶與豬胰彈性蛋白酶一樣，具有廣泛的水解活性，不但能降解彈性硬蛋白，而且對(duì)酪蛋白、明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白、白蛋白等多種蛋白質(zhì)都有分解作用，是一種廣譜的肽鏈內(nèi)切酶。利用微生物大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)彈性蛋白酶在國外早已開始，并取得了巨大進(jìn)展，已經(jīng)出現(xiàn)了商品化的彈性蛋白酶[5]。國外學(xué)者已發(fā)現(xiàn)一系列具有產(chǎn)彈性蛋白酶能力的微生物，包括P.aeruginosa、F. immotum、B. subtilis等[6-8]。近年來，國內(nèi)學(xué)者也從土壤中分離出大批菌株，經(jīng)鑒定這些菌株大多屬于芽孢桿菌屬[9-11]。本課題組在前期研究中從肉聯(lián)廠和屠宰場(chǎng)附近的土壤中分離篩選獲得一株高產(chǎn)彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌[12]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶進(jìn)行分離純化并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的開發(fā)應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis ZJUEL31410為本課題組從土壤中分離所得，現(xiàn)保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC 1397。

剛果紅-彈性蛋白、Marker蛋白 美國Sigma公司；酪蛋白 上海研生生化試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Fluka公司；Sephadex G-100 美國Phamacia公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白11.30、葡萄糖74.0、玉米提取物6.16、K2HPO22.06、MgSO4·2H2O 0.34，pH7.5。

1.2 儀器與設(shè)備

HD-93-1型核酸蛋白檢測(cè)儀 上海金達(dá)生化儀器廠；恒流泵、分步收集器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；JS-380A自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司；DH-8D型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；Beckman冷凍高速離心機(jī) 美國Beckman公司； TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Christ ALPHA 1-4 LD Plus針孔冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司。

1.3 培養(yǎng)方法

斜面種子活化完成后，轉(zhuǎn)接一環(huán)用于液體種子的培育，37℃培養(yǎng)18h后，按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在旋轉(zhuǎn)式搖床上于37℃、轉(zhuǎn)速220r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h。250mL三角瓶中液體種子和發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為25mL。

1.4 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性測(cè)定

彈性蛋白酶活力測(cè)定采用分光光度法，見文獻(xiàn)[12]。稱取20mg剛果紅-彈性蛋白溶于1mL水中，加1mL pH7.4、0.2mol/L的硼酸緩沖液和1mL適當(dāng)稀釋的酶液于37℃振蕩反應(yīng)20min，加入pH6.0、0.7mol/L磷酸鈉緩沖液2mL終止反應(yīng)，過濾后取上清液在波長495nm處測(cè)定光密度，采用蒸餾水替代酶液的反應(yīng)體系為空白。在此反應(yīng)條件下溶解1mg剛果紅-彈性蛋白底物所需的酶量定義為1個(gè)彈性蛋白酶活力單位(U)。

1.5 硫酸銨分級(jí)鹽析

硫酸銨分級(jí)鹽析方法參見文獻(xiàn)[13]。

1.6 SephadexG-100凝膠柱層析

鹽析獲得的沉淀物溶解于0.2mol/L pH7.4硼酸緩沖液中，活性炭脫色后，用0.2mol/L的硼酸緩沖液透析至透析液中檢測(cè)不到銨根離子，過Sephadex G-100柱(3cm× 100cm)，用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為15mL/h，用核酸/蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)，分步收集有酶活性組分，每管2mL，用去離子水透析過夜，冷凍濃縮后于4℃保存，用于SDS-PAGE電泳和酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.7 SDS-PAGE電泳

采用垂直式SDS-PAGE凝膠電泳，12%的分離膠和5%的濃縮膠，其具體實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟見文獻(xiàn)[14]，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳所得的條帶進(jìn)行分析，以驗(yàn)證各純化步驟的效果并確定彈性蛋白酶的分子質(zhì)量。

1.8 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.8.1 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶分子質(zhì)量測(cè)定

將樣品與已知分子質(zhì)量的蛋白Marker進(jìn)行SDSPAGE電泳，然后以相對(duì)遷移率計(jì)算出地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的分子質(zhì)量。

1.8.2 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶最適反應(yīng)pH值測(cè)定

將地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶分別加到pH值為6.0、6.5、7.0、7.4、8.0、8.5、9.0的緩沖液中，在37℃條件下測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，其他與之相比計(jì)算相對(duì)酶活力，考察酶最適反應(yīng)pH值。

1.8.3 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶最適反應(yīng)溫度測(cè)定

地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶在最適反應(yīng)pH值條件下，分別在不同溫度(30、37、45、50、55、60、70℃)條件下測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，其他與之相比計(jì)算相對(duì)酶活力，考察酶最適反應(yīng)溫度。

1.8.4 金屬離子對(duì)地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性的影響

將地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶分別加到含0.3、3mol/L的Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+的溶液中，37℃保溫4h后，在37℃、pH7.4條件下測(cè)定酶活力，以浸泡前的酶活力為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活力，考察酶的金屬離子穩(wěn)定性。

1.8.5 彈性蛋白酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

在pH7.4條件下，配制不同濃度的剛果紅-彈性蛋白底物，37℃條件下反應(yīng)，測(cè)定彈性蛋白酶的反應(yīng)初始速率，以反應(yīng)速率倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)，底物濃度倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)作圖，得到斜率為Km/vmax的直線，由此得到Km值。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的純化

在最佳產(chǎn)酶條件下，發(fā)酵制備得到地衣芽孢桿菌的發(fā)酵液，經(jīng)過離心，其上清液即為粗酶液。粗酶液經(jīng)不同飽和度的硫酸銨沉淀后測(cè)定酶活力。結(jié)果表明地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶主要集中在40%～70%硫酸銨飽和度的沉淀中，因此硫酸銨分級(jí)沉淀范圍為40%～70%飽和度。將硫酸銨分級(jí)沉淀后得到的蛋白溶液透析濃縮，用Sephadex G-100凝膠層析柱層析純化，結(jié)果見表1，兩步純化后，地衣芽孢桿菌蛋白酶純化了近13倍。

表1 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶純化步驟及其結(jié)果Table 1 Separation and purification procedures for Bacillus sp. EL31410 elastase

2.2 SDS-PAGE檢測(cè)地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的純度

圖1 SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE of crudely separated elastase and purified elastase

從圖1可以看出，經(jīng)各步純化后電泳圖譜中蛋白質(zhì)條帶依次減少，Sephadex G-100柱層析后得到一條帶，即純化后的地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶條帶。將該條帶與Marker標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對(duì)比并根據(jù)相對(duì)遷移率可計(jì)算出地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶分子質(zhì)量大約為29.5kD。

2.3 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 酶的最適作用pH值

圖2 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適作用pH值Fig.2 Optimal reaction pH of Bacillus sp.EL31410 elastase

如圖2所示，地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶與底物的最適反應(yīng)pH值為7.4，且在pH7.4～8.0的堿性條件下酶活力較好。

2.3.2 酶的最適反應(yīng)溫度

圖3 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的最適作用溫度Fig.3 Optimal reaction temperature of Bacillus sp.EL31410 elastase

如圖3所示，地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶在55℃時(shí)酶活力最高，故最適反應(yīng)溫度為55℃，而且在60℃時(shí)相對(duì)酶活力與55℃非常接近，僅下降了8%，而60～70℃時(shí)相對(duì)酶活力下降很快，70℃時(shí)酶活力只剩最高時(shí)的55%。

2.3.3 金屬離子對(duì)地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性的影響

表2 不同金屬離子對(duì)地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性的影響Table 2 Effect of different metal ions on Bacillus sp.EL31410 elastase activity

從表2可知，高濃度的金屬離子對(duì)地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活力影響很大，尤其是高濃度的Zn2+和Al3+，在此條件下酶幾乎失活。在這6種金屬離子中，低濃度的Ca2+和K+能激活地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性，而Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+可不同程度地抑制地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活性，與谷新晰等[15]在重組畢赤酵母中獲得的彈性蛋白酶性質(zhì)相似。

2.3.4 彈性蛋白酶的酶解動(dòng)力學(xué)

以剛果紅-彈性蛋白為底物測(cè)定了地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的酶解動(dòng)力學(xué)常數(shù)，以1/v對(duì)1/[S]做圖得一直線，經(jīng)計(jì)算得出線性方程為y=44.139x＋4.5637。如圖4所示，直線的斜率為Km/vmax，直線與縱軸交于1/vmax，與橫軸交于-1/Km。從方程可知，Km為9.67mg/mL。

圖4 地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的酶解Lineweaver-Burk圖Fig.4 Lineweaver-Burk plot of elastase with elastin-Congo red as the substrate

3 結(jié) 論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用兩步法純化地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶，同時(shí)用SDS-PAGE測(cè)定其分子質(zhì)量。結(jié)果顯示，利用40%～70%的硫酸銨分級(jí)鹽析和Sephadex G-100凝膠層析后，地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶比活力較粗酶液提高了近13倍，在SDS-PAGE凝膠圖譜中得到比較明晰的條帶，計(jì)算出其分子質(zhì)量約為29.5kD。

3.2 通過對(duì)層析純化后地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，其最適作用溫度為55℃，最適作用pH值為7.4。此外，考察了多種金屬離子對(duì)地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度Ca2+和K+對(duì)其有激活作用，而其他離子可不同程度地抑制其活性。以剛果紅-彈性蛋白為底物，對(duì)地衣芽孢桿菌彈性蛋白酶的酶解動(dòng)力學(xué)常數(shù)進(jìn)行了研究，其酶解反應(yīng)的米氏常數(shù)Km為9.67mg/mL。

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Purification and Characteristics of Elastase Produced by Bacillus licheniformis

FU Ming-liang，LIU Xiao-jie，LIU Jing，HE Guo-qing，CHEN Qi-he*
(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

The fermentation supernatant (rich in elastase) of Bacillus licheniformis ZJUEL31410, a strain isolated from soil, was used as a crude enzyme solution, from which elastase was separated by (NH4)2SO4segmentation precipitation and purified by Sephadex gel column chromatography. The enzymatic characteristics of purified elastase were measured. The specific activity of elastase could be increased to 120 U/mg through (NH4)2SO4precipitation with 40%-70% saturation degree and continually increased to 292 U/mg after Sephadex gel column purification and the purification fold was 12.6. SDS-PAGE studies demonstrated that the enzyme had a molecular weight of 29.5 kD. The optimum reaction temperature and pH were 55 ℃ and 7.4, respectively, and the Michaelis constant Km was 9.67 mg/mL with elastin-Congo red as the substrate. Low concentrations of Ca2+and K+could enhance elastase activity, while Mg2+, Mn2+, Zn2+and Al3+revealed an inhibition effect.

Bacillus licheniformis ZJUEL31410；elastase；purification；enzymatic properties

TS201

A

1002-6630(2011)07-0216-04

2010-06-06

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y307405)

傅明亮(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：fuml@zju.edu.cn

*通信作者：陳啟和(1975—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)與生物工程。E-mail：chenqh@zju.edu.cn