李常營，盧曉霆，于志會，張 雪，李 達，牛春華，王 輯，楊貞耐,,,*

(1.長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林 長春 130012；2.吉林大學生物與農業(yè)工程學院，吉林 長春 130022；3.吉林省農業(yè)科學院農產品加工研究中心，吉林 長春 130033；4.吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130018)

酸菜來源植物乳桿菌S4-5的降膽固醇作用

李常營1，盧曉霆1，于志會2，張 雪3，李 達3，牛春華3，王 輯4，楊貞耐2,3,4,*

(1.長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林 長春 130012；2.吉林大學生物與農業(yè)工程學院，吉林 長春 130022；3.吉林省農業(yè)科學院農產品加工研究中心，吉林 長春 130033；4.吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130018)

對酸菜來源植物乳桿菌S4-5的體外降膽固醇作用進行研究。采用單因素試驗研究膽鹽添加量、膽固醇添加量、培養(yǎng)基初始pH值及培養(yǎng)時間對植物乳桿菌S4-5降膽固醇能力的影響，結果表明：在膽鹽質量濃度為1.0mg/mL和膽固醇質量濃度為175.7mg/L時，植物乳桿菌S4-5有最高的膽固醇移除率，分別為67.7%和62.2%；植物乳桿菌S4-5在培養(yǎng)基不同初始pH值條件下對膽固醇的移除率均在71.3%～77.2%之間；培養(yǎng)時間對植物乳桿菌S4-5的降膽固醇作用有顯著性影響(P＜0.01)，在培養(yǎng)2h(延滯期結束)、14h(指數期結束)、24h和48h后植物乳桿菌S4-5對膽固醇的移除率分別為4.8%、66.7%、75.3%和84.0%。

酸菜；植物乳桿菌；膽固醇

人們普遍認為高血清膽固醇是引發(fā)心腦血管疾病的重要因素之一，由于使用藥物降低體內膽固醇有一定的副作用，目前人們正尋找更加安全、有效的降低血清膽固醇的方法。Shaper等[1]和Mann等[2]均發(fā)現肯尼亞北部馬賽人的血脂水平較低，并認為和他們長期飲用自制發(fā)酵乳制品有關系。Mathara等[3]從這種發(fā)酵乳中分離出了23株乳酸菌，并對這些乳酸菌的益生作用進行了研究，結果表明部分乳桿菌有體外降膽固醇作用。而Nguyen等[4]從嬰兒腸道中分離出了植物乳桿菌PH04，并證實其有降膽固醇作用。因此利用乳酸菌降低膽固醇成為國內外研究的熱點，國內研究起步較晚但是發(fā)展較快，Zeng 等[5]從酸菜汁中分離出了一株布赫內氏乳桿菌P2，研究結果表明該菌株具有43.95%的體外膽固醇移除率。我國臺灣Wang等[6]在用乳桿菌發(fā)酵的薏苡乳灌喂田鼠的實驗中發(fā)現乳桿菌有顯著降低田鼠體內血清膽固醇水平的作用，并增加低密度脂蛋白的比例。但是不同的菌株對膽固醇的移除能力有差異，尤其是對作用機理的研究還不是很充分。

目前研究人員從發(fā)酵乳制品[3,7]、藏靈菇[8]、發(fā)酵肉制品[9]、發(fā)酵蔬菜制品[5]及人體腸道[4,10]等不同來源中均分離出了乳酸菌，并證實均有降膽固醇作用。東北酸菜是我國東北地區(qū)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，經過自然發(fā)酵而成，并含有大量的乳酸菌。因此從酸菜中分離出具有降膽固醇作用的菌株，開發(fā)新型功能性產品具有重要意義，本實驗對酸菜來源的一株植物乳桿菌S4-5進行體外降膽固醇研究，為研究乳酸菌降膽固醇的作用機理及其生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌S4-5由吉林省農業(yè)科學院農產品加工研究中心提供，分離于東北酸菜。

膽鹽(bile salt)、膽固醇(分析純)、巰基乙酸鈉(分析純) 美國Sigma公司；正己烷(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖2.0g、蛋白胨 1.0g、牛肉膏1.0g、酵母浸粉0.5g、無水乙酸鈉0.5g、檸檬酸鈉0.5g、磷酸氫二鉀0.2g、吐溫-80 0.1mL、七水硫酸鎂0.05g、硫酸錳0.005g、加水至100mL，pH6.6。

MRS-THIO培養(yǎng)基：巰基乙酸鈉0.2g，MRS培養(yǎng)基100mL。

1.2 儀器與設備

Evolution RC高速離心機 美國Thermo Sorvall公司；722可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膽固醇質量濃度的測定[11]

將培養(yǎng)后的菌液于4℃、6000×g離心10min，取上清液0.5mL于18mm×18cm試管中，依次加入3mL 體積分數為95%的乙醇和2mL 質量濃度為0.5g/mL的氫氧化鉀溶液，漩渦振蕩混勻后置于60℃水浴中皂化10min，迅速冷卻后加入5mL正己烷，漩渦振蕩1min進行萃取，靜置10min后加入3mL水，重復振蕩1min后在室溫靜置10min，待分層后取2.5mL正己烷層于15mm× 15cm試管中，置于60℃水浴中用氮氣吹干溶劑，加入4mL鄰苯二甲醛顯色劑，漩渦振蕩1min后靜置10min，加入2mL濃硫酸振蕩1min，室溫靜置10min后于波長550nm處測吸光度，根據膽固醇與吸光度標準曲線回歸方程計算膽固醇的質量濃度。

1.3.2 繪制膽固醇質量濃度與吸光度標準曲線

在含1.0mg/mL膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的膽固醇，37℃培養(yǎng)24h后測定培養(yǎng)基中膽固醇的質量濃度，以吸光度為橫坐標，膽固醇的質量濃度為縱坐標繪制工作曲線，進行函數擬合得到曲線回歸方程，用于計算膽固醇的質量濃度。膽固醇的移除率按下列公式計算：

式中：ρ1為培養(yǎng)后上清液膽固醇的質量濃度；ρ0為初始培養(yǎng)基總膽固醇的質量濃度。

1.3.3 膽鹽質量濃度對植物乳桿菌S4-5降膽固醇能力的影響

在添加175.7mg/L膽固醇的MRS-THIO培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的膽鹽，按體積分數3%接種量接種后37℃培養(yǎng)24h，4℃、6000×g離心10min后測定培養(yǎng)基中膽固醇的質量濃度，以未接種的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對照。每個實驗重復3次。

1.3.4 膽固醇質量濃度對植物乳桿菌S4-5降膽固醇能力的影響

在含1.0mg/mL膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的膽固醇，按體積分數3%接種量接種后37℃培養(yǎng)24h，4℃、6000×g離心10min后測定上清液中膽固醇的質量濃度，以未接種的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對照。每個實驗重復3次。

1.3.5 培養(yǎng)時間對植物乳桿菌S4-5降膽固醇能力的影響

在含1.0mg/mL膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基中添加膽固醇，使其最終質量濃度為175.7mg/L，按體積分數3%接種量接種后37℃培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)時間測定培養(yǎng)基中殘留膽固醇的質量濃度，同時在600nm波長處測定光密度值(OD600nm)繪制生長曲線，以未接種的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對照。每個實驗重復3次。

1.3.6 培養(yǎng)基初始pH值對植物乳桿菌S4-5降膽固醇能力的影響

在含1.0mg/mL膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基中添加膽固醇，使其最終質量濃度為175.7mg/L，并調節(jié)pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按體積分數3%接種量接種后37℃培養(yǎng)24h，4℃、6000×g離心10min后取上清液測定膽固醇質量濃度，以未接種的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對照。每個實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 膽固醇質量濃度與吸光度標準曲線

以吸光度(A550nm)為橫坐標，膽固醇質量濃度(mg/L)為縱坐標繪制曲線。結果顯示在較高膽固醇質量濃度時，膽固醇質量濃度和吸光度并不成線性關系，用Microsoft Excel 2003進行函數擬合。擬合方程為y =-302.5x2+ 517.62x-13.455(R2=0.9991)，式中：x為吸光度(A550nm)y為膽固醇的質量濃度/(mg/L)。

2.2 膽鹽質量濃度對植物乳桿菌S4-5降膽固醇能力的影響

圖1 植物乳桿菌S4-5在不同膽鹽質量濃度時的膽固醇移除率Fig.1 Cholesterol removal by L. plantarum S4-5 in the presence of different concentrations of bile salt

如圖1所示，膽鹽質量濃度對植物乳桿菌S4-5的降膽固醇能力有顯著影響(P＜0.05)，隨著膽鹽質量濃度的升高其降膽固醇能力逐次降低。在膽鹽質量濃度為1.0mg/mL時，植物乳桿菌S4-5對膽固醇的移除率為67.7%，隨著膽鹽質量濃度的升高，相應移除率逐漸降低；當膽鹽質量濃度達到10.0mg/mL時，只有約30.1%膽固醇被移除，和不加膽鹽的作用相似(32.9%)，這說明當膽鹽的質量濃度過高時會抑制植物乳桿菌S4-5降低膽固醇。Ramasamy等[12]的研究結果表明部分乳桿菌降膽固醇能力和膽鹽水解有一定的關系，說明了膽鹽的存在有利于菌體對膽固醇的移除，同時Parvez 等[13]通過實驗證實在膽鹽存在下雙歧桿菌有降膽固醇作用。但是高質量濃度膽鹽反而會降低移除率，這可能和高質量濃度膽鹽抑制菌體生長有關。

2.3 膽固醇質量濃度對植物乳桿菌S4-5降膽固醇能力的影響

圖2 植物乳桿菌S4-5在不同膽固醇質量濃度時的膽固醇移除率Fig.2 Cholesterol removal by L. plantarum S4-5 in the presence of different concentrations of cholesterol

如圖2所示，在添加不同質量濃度膽固醇的MRS-THIO培養(yǎng)基中，植物乳桿菌S4-5對膽固醇的移除率是不同的，結果顯示膽固醇質量濃度對植物乳桿菌S4-5的降膽固醇能力有顯著影響(P＜0.05)，隨著膽固醇質量濃度的增加，相應的膽固醇移除率也增大。當膽固醇添加量為175.7mg/L時，植物乳桿菌S4-5對膽固醇有最大移除率，為62.2%，當膽固醇質量濃度升高到195.2mg/L時其對膽固醇移除率反而下降為60.0%。Zeng等[5]認為同化吸收是布赫內氏乳桿菌P2降膽固醇的主要途徑，這表明乳桿菌在生長周期內隨著培養(yǎng)基中膽固醇質量濃度升高會吸附更多的膽固醇，當吸附達到飽和時，即使增加環(huán)境中膽固醇質量濃度，菌體細胞也不會再吸附更多的膽固醇。

2.4 培養(yǎng)基初始pH值對植物乳桿菌S4-5降膽固醇能力的影響

圖3 植物乳桿菌S4-5在不同培養(yǎng)基初始pH值條件下的膽固醇移除率Fig.3 Effect of initial pH of medium on cholesterol removal by L. plantarum S4-5

如圖3所示，在不同初始pH值MRS-THIO培養(yǎng)基中添加膽鹽(1.0mg/mL)和膽固醇(175.7mg/L)后，接種培養(yǎng)24h后發(fā)現植物乳桿菌S4-5對培養(yǎng)基中膽固醇的移除率均在71.3%～77.2%之間，即使在低酸(pH3.5)環(huán)境下依然有較高的膽固醇移除率74.0%，這說明酸性環(huán)境可能促使膽固醇被移除。Klaver 等[14]研究結果表明酸性環(huán)境有利于膽酸和膽固醇共沉淀發(fā)生，從而降低膽固醇水平。在pH4.0～7.0范圍內，pH6.0時有最大膽固醇移除率(77.2%)，但是在偏堿性(pH8.0)環(huán)境下，植物乳桿菌S4-5仍有較高的膽固醇移除能力(75.2%)。其移除機理目前還不明確，但可能和菌體生長產酸使培養(yǎng)基酸化有關系。

2.5 培養(yǎng)時間對植物乳桿菌S4-5降膽固醇能力的影響

植物乳桿菌S4-5在不同培養(yǎng)時間膽固醇移除率有顯著差異(P＜0.01，圖4)，隨著培養(yǎng)時間延長其膽固醇移除率逐漸增大。在0～2h培養(yǎng)階段(延滯期，圖5)植物乳桿菌S4-5的膽固醇移除率增加緩慢，從0.6%增加到4.8%，在2～8h 培養(yǎng)階段(指數生長前期，圖5)膽固醇移除率緩慢增加，從4.8%增加到22.2%，而在8～14h培養(yǎng)階段(指數生長期后期，圖5)植物乳桿菌的移除率增加較快，相應的移除率為22.2%～66.7%，這說明植物乳桿菌S4-5的降膽固醇作用和菌體生長狀態(tài)有一定關系。Zhao等[15]的研究結果表明乳酸菌在培養(yǎng)初期12h有最大的移除量，本研究結果也表明植物乳桿菌S4-5在對數生長期對膽固醇的移除率快速增加，這說明膽固醇的移除和細胞生長有一定關系，Wang等[8]通過灌喂含植物乳桿菌制劑發(fā)現小鼠體內的膽固醇通過菌體細胞表面吸附方式隨糞便排出體外，進一步說明膽固醇的移除量和菌體的生長量有關系。Mishra等[16]的實驗結果表明干酪乳桿菌NCDC17在培養(yǎng)48h后有最大膽固醇移除量，本實驗結果也表明在培養(yǎng)48h后發(fā)現植物乳桿菌S4-5對膽固醇的移除率可達到84.0%(圖4)，進一步說明乳酸菌的降膽固醇作用和培養(yǎng)時間有關。

圖4 植物乳桿菌S4-5在不同培養(yǎng)時間的膽固醇移除率Fig.4 Time course of cholesterol removal by L. plantarum S4-5 during incubation

圖5 植物乳桿菌S4-5在MRS-THIO培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.5 Growth curve of L. plantarum S4-5 in MRS-THIO medium

乳酸菌降低膽固醇的作用機理一直是討論的熱點，研究人員主要是針對膽鹽、菌體細胞生長及培養(yǎng)基酸度等方面提出各種作用機理，有膽鹽共沉淀[14]，細胞表面吸附[11]等理論。但是隨著進一步研究，又有新的理論解釋乳酸菌降低膽固醇的現象，如Lye等[17]提出了5種降膽固醇作用機理，并認為是同時在起作用。同時，報道的布赫內氏乳桿菌P2在體外的膽固醇移除率為43.95%[5]，在大鼠飼喂中發(fā)現植物乳桿菌PH04有7%的降低體內總膽固醇作用[4]，而在本實驗中發(fā)現植物乳桿菌S4-5在體外的降膽固醇移除率達到了75.3%，對其體內的降膽固醇作用還需進一步研究。同時其作用機理目前還不明確，還需要進一步實驗說明培養(yǎng)基pH值對植物乳桿菌S4-5降膽固醇作用的影響。

3 結 論

植物乳桿菌S4-5在體外表現出良好的降膽固醇能力，在本實驗條件下培養(yǎng)24h能夠移除培養(yǎng)基中75.3%的膽固醇，在培養(yǎng)48h后其移除率可達到84.0%。其膽固醇移除率和菌體的生長狀態(tài)有關，同時培養(yǎng)時間越長膽固醇移除率越大，在低pH值環(huán)境下(pH3.5)，植物乳桿菌S4-5仍有較高的膽固醇移除率(74.0%)，這說明酸性環(huán)境有利于膽固醇的降低。為進一步研究植物乳桿菌S4-5的體內降膽固醇作用及移除膽固醇的作用機理提供參考。

[1] SHAPER A G, JONES K W, JONES M, et al. Serun lipids in three nomadic tribes of Northern Kenya[J]. The Aerican Journal of Clinical Nutrition, 1963, 13: 135-146.

[2] MANN G V, SPOERRY A. Studies of a surfactant and cholesteremia in the Maasai[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 1974, 27: 464-469.

[3] MATHARA J M, SCHILLINGER U, GUIGAS C, et al. Functional characteristics of Lactobacillus spp. from traditional Maasai fermented milk products in Kenya[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 126(1/2): 57-64.

[4] NGUYEN T D T, KANG J H, LEE M S. Characterization of Lactobacillus plantarum PH04, a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 113(3): 358-361.

[5] ZENG Xiaoqun, PAN Daodong, GUO Yuxing. The probiotic properties of Lactobacillus buchneri P2[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 108(6): 2059-2066.

[6] WANG Chungyi, WU Sheching, NG Changchai, et al. Effect of Lactobacillus-fermented adlay-based milk on lipid metabolism of hamsters fed cholesterol-enriched diet[J]. Food Research International, 2010, 43(3): 819-824.

[7] LIU Jeruei, WANG Shengyao, CHEN Mingju, et al. Hypocholesterolaemic effects of milk-kefir and soyamilk-kefir in cholesterol-fed hamsters[J]. British Journal of Nutrition, 2006, 95(5): 939-946.

[8] WANG Yanping, XU Nv, XI Aodeng, et al. Effects of Lactobacillus plantarum MA2 isolated from Tibet kefir on lipid metabolism and intestinal microflora of rats fed on high-cholesterol diet[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 84(2): 341-347.

[9] MANDAL V, SEN S K, MANDAL N C. Effect of prebiotics on bacteriocin production and cholesterol lowering activity of Pediococcus acidilactici LAB 5[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2009, 25(10): 1837-1847.

[10] PEREIRA D I A, GIBSON G R. Cholesterol assimilation by lactic acid bacteria and bifidobacteria isolated from the human gut[J]. Applied Environmental and Microbiology, 2002, 68(9): 4689-4693.

[11] GILLILAND S E, NELSON C R, MAXWELL C. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1985, 49 (2): 377-381.

[12] RAMASAMY K, ABDULLAH N, WONG M, et al. Bile salt deconjugation and cholesterol removal from media by Lactobacillus strains used as probiotics in chickens[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(1): 65-69.

[13] PARVEZ S, KIM H Y, LEE H C, et al. Bile salt hydrolase and cholesterol removal effect by Bifidobacterium bifidum NRRL 1976[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2006, 22(5): 455-459.

[14] KLAVER F A, van der MEER R. The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt-deconjugating activity[J]. Applied Environmental and Microbiology, 1993, 59(4): 1120-1124.

[15] ZHAO Ruixiang, SUN Junliang, MO Haizhen, et al. Analysis of functional properties of Lactobacillus acidophilus[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2007, 23(2): 195-200.

[16] MISHRA V, PRASAD D N. Application of in vitro methods for selection of Lactobacillus casei strains as potential probiotics[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 103(1): 109-115.

[17] LYE H S, RAHMAT-ALI G R, LIONG M T. Mechanisms of cholesterol removal by Lactobacilli under conditions that mimic the human gastrointestinal tract[J]. International Dairy Journal, 2010, 20(3): 169-175.

Cholesterol Removal by Lactobacillus plantarum S4-5 Isolated from Pickle

LI Chang-ying1，LU Xiao-ting1，YU Zhi-hui2，ZHANG Xue3，LI Da3，NIU Chun-hua3，WANG Ji4，YANG Zhen-nai2,3,4,*
( 1. School of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China；2. College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130022, China；3. Center of Agro-Food Technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China；4. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130018, China)

The aim of the present study was to evaluate the in vitro cholesterol removal ability of Lactobacillus plantarum S4-5, a strain isolated from pickle. Single factor experiments were carried out to explore the influences of oxgall addition, cholesterol addition, medium pH and incubation time on the ability of the strain to remove cholesterol in vitro. The results showed that the strain revealed the highest cholesterol removal rate in the media containing 1.0 mg/mL of oxgall or 175.7 mg/L of cholesterol, reaching 67.7% and 62.2%, respectively. A cholesterol removal rate ranging from 71.3% to 77.2% was observed under varying medium initial pH conditions. Incubation time had a significant impact on the cholesterol removal ability of Lactobacillus plantarum S4-5, and the removal rates after 2 (the end of the lag phase), 14 (the end of the exponential phase), 24 hours and 48 hours were 4.8%, 66.7%, 75.3% and 84.0%, respectively.

pickle；Lactobacillus plantarum；cholesterol

Q939.11

A

1002-6630(2011)07-0069-04

2010-07-27

國家自然科學基金項目(30670057)；國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資助項目(nycytx-0502)

李常營(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：liyinglove2008@vip.qq.com

*通信作者：楊貞耐(1965—)，男，研究員，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：zyang@cjaas.com