俞思明，朱思明*，于淑娟，林景聰，許 敏

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

配位對(duì)二氫楊梅素晶體結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的影響

俞思明，朱思明*，于淑娟，林景聰，許 敏

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

食用植物有效成分的非晶化配位可能會(huì)產(chǎn)生新的或更好的藥物活性。本實(shí)驗(yàn)研究二氫楊梅素(DMY)與Cu配位的優(yōu)化工藝條件、配位前后DMY的晶體結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的變化。結(jié)果表明：DMY與Cu配合的最佳工藝條件為40℃、反應(yīng)時(shí)間60min、pH 9.5；配位后DMY的UV-Vis光譜最大吸收峰由292nm紅移至332nm；經(jīng)理論化學(xué)計(jì)算和FT-IR光譜證實(shí)，DMY的4位羰基和5位羥基O原子參與配位；配合物對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力提高，這可能和配位后DMY出現(xiàn)的非晶化現(xiàn)象有關(guān)。

二氫楊梅素(DMY)；Cu；配合物；抗氧化

食用植物有效成分配位后可能產(chǎn)生新的或更好的藥物活性，中藥配合物新藥是中藥新藥研制的新方向[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，某些食用植物有效成分的非晶化往往會(huì)提高其生物活性[2]。二氫楊梅素(3,5,7,3＇,4＇,5＇-六羥基2,3-雙氫黃酮醇，dihydromyricetin，DMY)，又稱(chēng)蛇葡萄素，雙氫楊梅素，是一類(lèi)雙氫黃酮醇類(lèi)化合物[3]。其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖l。在顯齒蛇葡萄屬植物中(如藤茶，主要分布于長(zhǎng)江流域以南的廣東、廣西等地)其含量高達(dá)20%[4]。有關(guān)研究表明DMY具有清除氧自由基，防止油脂食品氧化變質(zhì)及消炎、抑菌、降脂、抗腫瘤等生理活性[5-6]。有學(xué)者認(rèn)為二氫楊梅素可以螯合金屬離子并且螯合作用發(fā)生在3-羥基-4-羰基上或3',4'酚羥基上，從而消除金屬離子對(duì)自由基氧化的催化作用[7-8]。國(guó)內(nèi)外對(duì)DMY與鐵、鋅離子的螯合產(chǎn)物的研究已經(jīng)很多。但是，有關(guān)DMY與Cu螯合產(chǎn)物的晶體結(jié)構(gòu)、抗氧化性變化及兩者之間關(guān)系的研究報(bào)道還較少，缺乏系統(tǒng)性的研究。

本實(shí)驗(yàn)探討人體必需微量元素Cu與DMY的配合的最佳工藝條件，以及配位前后DMY抗氧化活性的變化和晶體結(jié)構(gòu)變化，以期改善配體DMY的生物活性或發(fā)現(xiàn)新的生物活性，尋找DMY配位后反應(yīng)活性變化的非晶化根據(jù)。

圖1 二氫楊梅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of dihydromyricetin (DMY)

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

二氫楊梅素 參考文獻(xiàn)[9]自制；無(wú)水乙醇 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉、氯化銅 天津市科茂化學(xué)試劑有限公司。

S11-2恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；LDA-2A真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；TU-1810 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；FT-IR-650傅里葉紅外光譜儀 天津港東科技發(fā)展股份有限公司；D8 ADVANCE XRD儀 德國(guó)Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 DMY-Cu配合物合成的單因素試驗(yàn)

1.2.1.1 反應(yīng)pH值的確定

DMY在堿性條件下易與金屬離子發(fā)生配合反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，但其在強(qiáng)堿作用下會(huì)發(fā)生徹底的不可逆解環(huán)[10]，因此僅考察pH值范圍8.0～10.0。將1.0×10-3mol/L的DMY乙醇溶液與等物質(zhì)的量濃度等體積的CuCl2-乙醇溶液在帶三口燒瓶(帶攪拌和冷凝)中，在反應(yīng)溫度40℃和反應(yīng)時(shí)間60min條件下進(jìn)行試驗(yàn)，探討pH值對(duì)配合反應(yīng)的影響。反應(yīng)液中會(huì)產(chǎn)生配合物的沉淀，根據(jù)離心分離后上清液的OD332nm(332nm是DMY-Cu配合物的特征吸收波長(zhǎng))大小確定最佳反應(yīng)pH值。上清液于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中測(cè)定其OD332nm值，以其OD332nm值間接反映產(chǎn)率的大小(上清液的OD332nm反應(yīng)結(jié)晶母液中殘留配合物濃度，由于DMY和Cu的配比完全一致，則OD332nm越大，反應(yīng)溶液中殘留配合物越多，產(chǎn)率越低，下同)。

1.2.1.2 反應(yīng)時(shí)間的確定

試驗(yàn)方法同上。選取反應(yīng)時(shí)間15、30、45、60min和75min，反應(yīng)pH 9.5，反應(yīng)溫度40℃的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)離心分離后上清液的OD332nm大小確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.1.3 反應(yīng)溫度的確定

試驗(yàn)方法同上。選取反應(yīng)溫度40、50、60℃和70℃，在pH9.5，反應(yīng)時(shí)間60min的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)離心分離后上清液的OD332nm大小確定最佳反應(yīng)溫度。

1.2.2 二氫楊梅素Cu配合物的制備

在帶有攪拌器、干燥管、冷凝管的三口燒瓶中加入0.02mol/L 的DMY的無(wú)水乙醇溶液，加入等物質(zhì)的量的CuCl2的無(wú)水乙醇溶液，用5g/100mL的NaOH-乙醇溶液調(diào)節(jié)pH9.5，于40℃下反應(yīng)回流lh，產(chǎn)生淺褐色沉淀。反應(yīng)液冷卻至室溫后在4000r/min離心10min，分離上清液。沉淀先用乙醇洗滌，再用水洗數(shù)次，固體產(chǎn)物在40℃真空干燥箱中干燥即可。

1.2.3 量子化學(xué)計(jì)算[11]

運(yùn)用Hyperchem 軟件對(duì)DMY分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并進(jìn)行半經(jīng)驗(yàn)的全略微分重疊(CNDO/2)計(jì)算，根據(jù)分子中各O原子所帶電荷對(duì)DMY分子可能配位位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 DMY及DMY-Cu對(duì)羥自由基的清除作用測(cè)定

在25mL比色管中依次加入3mL 2mmol/L Fe3O4、3mL 1mmol/L H2O2溶液，搖勻，再加入3mL 6mmol/L 水楊酸，搖勻，于37℃水浴加熱15min后取出，測(cè)其吸光度A0。另取25mL 比色管依次加入3mL 2mmol/L FeSO4、3mL 1mmol/L H2O2溶液，搖勻，分別加入1.5×10-2mol/L待測(cè)液0.0、1.0、2.0、3.0mL，于37℃水浴中加熱15min后取出，然后再加入6mmol/L 水楊酸溶液3mL，繼續(xù)水浴加熱15min，取出用蒸餾水補(bǔ)充至25mL，搖勻，測(cè)其吸光度Ai[12]。

1.2.5 DMY及其Cu配合物的光譜分析和XRD分析

配制DMY及DMY-Cu的乙醇溶液并在200～600nm波長(zhǎng)處測(cè)定其紫外吸收光譜。取約1mgDMY及其Cu配合物分別與約100mg的KBr在瑪瑙研缽中研磨混合均勻，分別取少許上述混合物倒入壓片模中，用壓片器壓制成透明薄片，進(jìn)行紅外光譜分析。在相同條件下使用X 射線衍射儀對(duì)DMY及其Cu配合物進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)條件：Cu靶，40kV，40mA，步長(zhǎng)0.02°，掃描速度17.7s/步。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同工藝條件對(duì)配合反應(yīng)的影響

2.1.1 pH值對(duì)配合反應(yīng)的影響

圖2 pH值對(duì)配合反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of pH on coordination reaction

由圖2可知，pH值對(duì)配合反應(yīng)的影響較大，pH值在8.0～9.0間變化，上清液的OD332nm值急劇下降，說(shuō)明在堿性條件下有利于配合反應(yīng)進(jìn)行，DMY-Cu配合物產(chǎn)率升高；pH 9.5時(shí)OD332nm值達(dá)到最小，產(chǎn)率達(dá)到最大；但當(dāng)pH值超過(guò)9.5時(shí)上清液的OD332nm值又開(kāi)始上升，分析其原因可能是由于pH值過(guò)高，DMY的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，配合反應(yīng)不能順利進(jìn)行導(dǎo)致產(chǎn)率下降。

2.1.2 溫度對(duì)配合反應(yīng)的影響

圖3 溫度對(duì)配合反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of temperature on coordination reaction

由圖3可知，反應(yīng)溫度為40℃，溫度升高配合反應(yīng)正向進(jìn)行，產(chǎn)率增加；反應(yīng)溫度在40～60℃范圍內(nèi)時(shí)，轉(zhuǎn)化率雖增加，但配合物溶解度增加，沉淀量下降，產(chǎn)量下降，這可同任志秋等[13]的結(jié)果相驗(yàn)證；反應(yīng)溫度達(dá)到70℃后，高溫下配合物可能不穩(wěn)定，變成其他物質(zhì)，產(chǎn)率下降。

2.1.3 時(shí)間對(duì)配合反應(yīng)的影響

圖4 時(shí)間對(duì)配合反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of time on coordination reaction

由圖4可知，在15～60min的反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，上清液的OD332nm值逐漸減小，在60min時(shí)達(dá)到最小值，此時(shí)產(chǎn)率達(dá)到最大；隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)一步增加，上清液的OD332nm值略有增加，產(chǎn)率逐漸降低，分析其原因可能是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)一定程度的逆反應(yīng)。

2.2 DMY及其Cu配合物的紫外-可見(jiàn)光譜分析

圖5 DMY及DMY-Cu的紫外可見(jiàn)光譜圖Fig.5 UV-visible spectra of DMY and DMY-Cu complex

由圖5可知，DMY在292nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與Cu配位后，其在332nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)最大吸收，特征吸收峰發(fā)生40nm紅移現(xiàn)象，說(shuō)明有DMY-Cu配合產(chǎn)物的生成。

2.3 DMY及其Cu配合物的紅外光譜分析

圖6 DMY及DMY-Cu配合物的紅外光譜Fig.6 FT infrared spectra of DMY and DMY-Cu complex

由圖6可知，DMY-Cu配合物在3300～3500cm-1處有強(qiáng)吸收峰，這是O-H的特征峰，說(shuō)明配合物中酚羥基的存在，但吸收峰的寬度沒(méi)有DMY寬，說(shuō)明DMY-Cu配合物中酚羥基數(shù)可能比DMY中少；DMY-Cu配合物在1467cm-1處仍存在強(qiáng)吸收峰，在芳環(huán)骨架振動(dòng)C＝C頻率區(qū)1450～1600cm-1內(nèi)，說(shuō)明DMY-Cu苯環(huán)結(jié)構(gòu)還存在；分子中C-O-C鍵的振動(dòng)頻率(1050～1250cm-1)基本未變，表明DMY的C環(huán)醚鍵在選用配位條件下未發(fā)生開(kāi)環(huán)；DMY在1644cm-1處有強(qiáng)吸收峰，這是4位羰基產(chǎn)生的強(qiáng)吸收峰，DMY和Cu形成DMY-Cu后，由于金屬的配合作用，降低了4位羰基上碳氧原子的電子云密度，使碳氧雙鍵減弱，吸收峰的位置移至1626cm-1處。同時(shí)，在指紋區(qū)601cm-1處出現(xiàn)新的強(qiáng)吸收峰，這是M-O鍵的吸收峰，說(shuō)明確實(shí)有DMY-Cu配合物的生成。

2.4 DMY配位位點(diǎn)的量子化學(xué)計(jì)算分析

圖7 計(jì)算后DMY分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.7 Chemical structure of DMY after theoretical quantum chemistry calculation

由圖7可知，4位羰基O原子所帶電荷為-0.319(相對(duì)電荷，相當(dāng)于一個(gè)電子所帶電荷的0.319倍，下同)，在8個(gè)O原子的電荷值中最大，故預(yù)測(cè)DMY分子中4位羰基O原子肯定參與了配位，這可從2.3節(jié)的紅外光譜分析中得到驗(yàn)證。另外，3位羥基和5位羥基O原子電荷值分別為-0.291和-0.278，明顯大于其他O原子電荷值，故3位和5位羥基O原子是可能的配位位點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)[10]和[14]報(bào)道，DMY能以4位羰基和5位羥基與Zn和Cu配位，DMY與Cu配位的物質(zhì)的量比為1:1，以4位羰基和5位羥基與Cu配位, 這與A環(huán)和4位羰基的π-π共軛有關(guān)。

2.5 DMY及DMY-Cu的XRD分析

圖8 DMY及其Cu配合物的衍射圖譜Fig.8 XRD spectra of DMY and DMY-Cu complex

由圖8可知，DMY在2θ為11.376°、14.589°和22.948°處有強(qiáng)衍射峰，而DMY-Cu的特征衍射峰出現(xiàn)在2θ為28.982°、33.787°處，而DMY在此處卻無(wú)衍射峰，說(shuō)明DMY與Cu發(fā)生了配位反應(yīng)。而且，DMY和Cu配位后，出現(xiàn)彌散衍射特征，而DMY的XRD圖中僅有尖峰衍射特征，說(shuō)明DMY與Cu配位后出現(xiàn)非晶化現(xiàn)象[15]。

2.6 DMY及DMY-Cu對(duì)羥自由基的清除作用測(cè)定

圖9 DMY及DMY-Cu配合物對(duì)·OH的清除率Fig.9 Scavenging rates of DMY and DMY-Cu against hydroxyl free radicals

由圖9可知，DMY及DMY-Cu對(duì)·OH有很好的清除效果，且清除效果隨濃度的增大而增大。當(dāng)濃度在1.5×10-2mol/L時(shí)，兩者的清除率是一樣的，但當(dāng)濃度大于1.5×10-2mol/L時(shí)，DMY-Cu的清除效果優(yōu)于DMY。分析其原因可能是DMY-Cu配合物有類(lèi)似超氧化物歧化酶(SOD)的活性，并消除了金屬離子對(duì)自由基氧化的催化作用；另外，DMY與Cu配位后的非晶化現(xiàn)象也是可能的原因。

3 結(jié) 論

3.1 通過(guò)單因素試驗(yàn)確定DMY-Cu配合反應(yīng)的最佳工藝條件是溫度40℃、pH9.5、反應(yīng)時(shí)間為60min。

3.2 UV-Vis、XRD、FT-IR和理論量子化學(xué)計(jì)算分析結(jié)果表明，DMY的5位羥基和4位羰基與Cu發(fā)生非晶化配位。在實(shí)驗(yàn)條件下，DMY的C環(huán)沒(méi)有開(kāi)環(huán)，還有部分羥基未參與配位。

3.3 實(shí)驗(yàn)證明DMY-Cu配合物對(duì)·OH具有很好的清除能力，且清除效果明顯優(yōu)于DMY，即與DMY-Cu配合物的抗氧化能力優(yōu)于DMY。這可能DMY配位后的非晶化以及DMY-Cu有類(lèi)似超氧化物歧化酶活性有關(guān)。

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Effect of Coordination on Crystal Structure and Antioxidant Activity of Dihydromyricetin

YU Si-ming，ZHU Si-ming*，YU Shu-juan，LIN Jing-cong，XU Min
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Non-crystallization coordination of bioactive ingredients in edible plants can generate new or better pharmacological activity. In this paper, the optimal reaction conditions between dihydromyricetin (DMY) and Cu2+, the effect of coordination on the crystal structure and antioxidant activity of DMY were investigated. Results indicated that the optimal reaction conditions were reaction temperature of 40 ℃, reaction time of 60 min and reaction pH of 9.5. The characteristic absorption peaks were 332 nm for DMY-Cu complex and 292 nm for DMY, which may be ascribed to the oxygen from 4 carbonyl and 5 hydroxyl groups participated in coordination according to FT-IR analysis and theoretical chemical calculation of DMY or its complex. In addition, the scavenging capability of DMY against hydroxyl free radicals (·OH) was increased due to the non-crystallization coordination according to XRD analysis of DMY and its complex.

DMY；Cu；complex；antioxidation

O623.54

A

1002-6630(2011)07-0034-04

2010-05-26

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目 (2008A080403009)；2008—2009年度學(xué)生研究計(jì)劃(SRP)項(xiàng)目(Y1090070)

俞思明(1985—)，男，碩士研究生，主要從事制糖工程研究。E-mail：tayiya@126.com

*通信作者：朱思明(1976—)，男，講師，博士，主要從事植物有效成分的資源利用和化學(xué)改性研究。

E-mail：lfsmzhu@scut.edu.cn